一种从介观尺度到微观尺度的神经元成像组织清除方法

摘要

该协议提供了使用组织清除方法ScaleSF在脑切片中进行神经元成像的详细方法。该方案包括脑组织制备，组织澄清，清除切片的处理以及从介观到微观水平的神经元结构的共聚焦激光扫描显微镜成像。

摘要

这里提供了一个详细的方案，以可视化脑组织中从介观到微观水平的神经元结构。从神经回路到亚细胞神经元结构的神经元结构在用ScaleSF光学清除的小鼠脑切片中可视化。这种清除方法是ScaleS的改进版本，是一种用于组织切片的亲水性组织清除方法，可实现强大的清除能力以及高水平的荧光信号保存和结构完整性。可定制的三维（3D）打印成像室设计用于可靠地安装已清除的脑组织。注射携带增强绿色荧光蛋白基因的腺相关病毒载体的小鼠大脑用4%多聚甲醛固定，并用振动组织切片机切成1-mm厚的切片。通过遵循清除方案清除脑切片，其中包括在三种溶液中的顺序孵育，即ScaleS0溶液，磷酸盐缓冲盐水（-）和ScaleS4溶液，共10.5-14.5小时。将清除的脑切片安装在成像室上，并嵌入溶解在ScaleS4D25（0）溶液中的1.5%琼脂糖凝胶中。切片的3D图像采集是使用共聚焦激光扫描显微镜进行的，该显微镜配备了长工作距离的多浸入物镜。从介观神经元成像开始，我们成功地在光学清除的脑切片中可视化精细的亚细胞神经元结构，如树突状棘和轴突。该协议将有助于理解从电路到亚细胞组分尺度的神经元结构。

引言

组织清除方法改进了光学显微镜对生物和临床样品的深度无关成像，允许提取完整组织^{的结构信息1，2}。光学清除技术也可能潜在地加快速度，并降低组织学分析的成本。目前，有三种主要的清除方法可用:亲水，疏水和基于水凝胶的方法^1，2。亲水方法在保持荧光信号和组织完整性方面超越了，并且与其他两种方法相比毒性更小^3，4。

亲水性清除方法ScaleS以其保持结构和分子完整性以及强大的清除能力（清除 - 保存光谱）^而具有独特的地位。在之前的一项研究中，我们通过修改ScaleS⁶的清除程序，为组织切片（〜1mm厚度）开发了一种快速等距清除方案ScaleSF。这种清除方案需要在三种溶液中连续孵育10.5-14.5小时的脑切片。该方法具有高清除保存光谱的特点，甚至与电子显微镜（EM）分析兼容（补充图1），允许多尺度高分辨率三维（3D）成像和准确的信号重建⁶。因此，ScaleSF应该有效，特别是在大脑中，神经元细胞精心设计了巨大的繁荣过程，并安排了用于传输和接收信息的专用精细亚细胞结构。从神经元细胞的回路到亚细胞水平提取具有尺度的结构信息对于更好地理解大脑功能非常有用。

在这里，我们提供了一个详细的方案，使用ScaleSF可视化神经元结构，其尺度从介观/电路到微观/亚细胞水平。该方案包括组织制备、组织澄清、清除组织的处理以及已清除组织的共聚焦激光扫描显微镜 （CLSM） 成像。我们的实验方案侧重于询问从电路到亚细胞组分量表的神经元结构。有关制备溶液和将腺相关病毒（AAV）载体注射到小鼠大脑中的详细程序，请分别参考Miyawaki等人2016⁷ 和Okamoto et al. 2021⁸。

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研究方案

所有实验均由顺天堂大学动物护理和使用委员会批准（批准号2021245，2021246），并根据日本科学理事会（2006年）的动物实验正确进行基本准则进行。这里，使用雄性C57BL / 6J小鼠注射携带增强绿色荧光蛋白（EGFP）基因的AAV载体和小白蛋白（PV）/肉豆蔻酰化-EGFP-低密度脂蛋白受体C端细菌人工染色体（BAC）转基因小鼠（PV-FGL小鼠）⁹ 。PV-FGL小鼠维持在C57BL / 6J背景中。在这项研究中未发现基于性别的差异。

1. 组织制备

1. 灌注固定
   注意:在通风橱中执行步骤 1.1.1 至 1.1.3 以限制多聚甲醛 （PFA） 的暴露。
   1. 通过腹腔注射过量的戊巴比妥钠（200mg / kg）麻醉成年雄性小鼠（8-16周龄）。通过无脚趾夹断和眨眼反射来确认麻醉的充分性。
   2. 打开胸腔，用手术剪刀切开右心耳。使用连接到20mL注射器的23G针头向小鼠灌注20mL冰冷磷酸盐缓冲盐水（PBS），然后使用另一个20mL注射器在0.1M磷酸盐缓冲液（PB）中灌注20mL冰冷的4%PFA。
      注意:PFA是有毒和致畸的。避免吸入或接触皮肤、眼睛和粘膜。
   3. 用镊子从颅骨上取下脑组织。将脑组织转移到含有4%PFA的15 mL管中，0.1 M PB，保护样品免受光照，并在4°C下以50-100rpm的振荡器轻轻摇动过夜。
   4. 注意:收获的脑组织可以在4°C下在PBS中的0.02%叠氮化钠（NaN₃）中储存数周。
      注意:NaN₃ 是有毒的。避免吸入或接触皮肤、眼睛和粘膜。将其放在通风橱内。
2. 脑切片制备
   1. 通过在50 mL PBS中加入2克琼脂，在PBS中制备4%琼脂。微波加热混合物，直到琼脂完全溶解。让溶液冷却至40-45°C。
      注意:琼脂的主要成分菀果胶提供的粘性特性改善了组织切片的切割。
   2. 将10mL琼脂溶液加入6孔培养板中。使用镊子将脑组织浸没在琼脂溶液中。让琼脂在冰上凝固。
   3. 从井中取出嵌入的脑组织，并用剃须刀片修剪琼脂。用超级胶水将琼脂块固定在振动浴槽的底部，并将0.1 M PB倒入缓冲液托盘中。
   4. 使用浸泡在乙醇中的无绒薄纸清洁另一个剃须刀片，并将刀片连接到振动纸巾切片机的刀片架上。
   5. 将切片速度设置为0.14 mm / s，振幅为1.4 mm，频率设置为75-77 Hz。将脑组织切成1 mm厚的切片，并将切片收集在含有PBS的6孔细胞培养板中。
      注意:脑切片可以在4°C下在PBS的0.02%NaN₃ 中储存数周。

2. 组织澄清

注:所使用的ScaleS溶液的成分列于 表1中。应通过用箔覆盖来保护样品免受光照。清除步骤如图 1A所示。

1. 将8mL ScaleS0溶液加入6孔细胞培养板的一个孔中，并将8mL ScaleS4溶液加入板的另一孔中，并在培养箱中预热至37°C。
2. 用刮刀将脑切片转移到预热的ScaleS0溶液中，并在37°C下以90rpm在振荡培养箱中孵育2小时。
3. 将透化的脑切片在8 mL PBS（–）中用刮刀在6孔细胞培养板中转移，并通过保持在40-60rpm的轨道振荡器中洗涤15分钟。重复两次。
4. 用刮刀将脑切片转移到预热的8mL ScaleS4溶液中，并通过在37°C下以90rpm振荡培养箱中孵育8-12小时来清除它们。 清除的大脑切片如图 1所示。

3. 脑切片安装

注意:可定制的成像室用于可靠地安装清除的脑切片（图2）⁶。腔室由腔室框架和底部盖玻片组成。显微镜载物台适配器还设计用于将成像室直接安装在显微镜载物台上（图2A，B）。腔室框架和显微镜载物台适配器可以使用内部或外包的3D打印服务进行3D打印。成像室的3D计算机辅助设计（CAD）数据在Furuta等人中提供 2022⁶.

1. 对于腔室制备，使用压敏粘合剂将腔室框架连接到盖玻片上。
2. 通过在瓶中加入1.5g琼脂糖到100mL溶液中，在Sca l eS4D25（0）溶液（ScaleS4凝胶）中制备1.5%琼脂糖。通过搅拌和微波加热溶液充分混合溶液，直到琼脂糖完全溶解。完成后，让溶液冷却至37°C。
3. 用刮刀将清除的脑切片安装到成像室的底部盖玻片上。使用干净的无绒薄纸擦去已清除切片中多余的溶液。
4. 使用微量移液管在脑切片上添加ScaleS4凝胶以填充成像室。用镊子将另一个盖玻片放在上面，并按此顺序在盖玻片上放置一块不起毛的薄纸和一张载玻片。
5. 将成像室转移到4°C的冰箱中。 将金属砝码放在载玻片上，静置 30 分钟。
6. 从成像室中取出金属砝码，载玻片，无绒薄纸和盖玻片，并擦去多余的凝胶（图2A，B）。
7. 将成像室置于60mm玻璃培养皿中，并用腻子状压敏粘合剂将成像室的边缘连接到培养皿上。将腔室在多个点上连接到培养皿上。
8. 将ScaleS4溶液倒入培养皿中，并在轨道振荡器上以40-60rpm在20-25°C下轻轻摇动1小时。用新鲜溶液代替，并使用200μL移液器吸头轻轻刮除凝胶表面上的气泡。将浸入式成像室安装在显微镜载物台上（图2C）。

4. 液晶屏成像

1. 使用配备长工作距离（WD）（16x/0.60数值孔径[NA]，WD = 2.5 mm）的多浸入式物镜的CLSM采集图像。
   注:高数值孔径物镜可提供高衍射极限分辨率。
2. 打开所有相关成像设备（工作站、显微镜、扫描仪、激光器和汞灯）并启动CLSM成像软件。
3. 将多浸入式物镜的校正环设置为1.47。ScaleS4溶液的折射率（RI）约为1.47^5，7。RI失配引起的像差会干扰图像的形成（图3）。
4. 将物镜浸入溶液中，让它慢慢接近切片。清除物镜尖端的所有气泡。使用落射荧光在清除的组织中查找感兴趣的区域 （ROI）。
5. 通过测试适当的设置来设置图像采集参数。
   1. 确定图像采集的位深度。图像的数据大小随着位深度的增加而增加。
   2. 设置检测波长。根据发射光谱调整探测器的适当栅极。确保检测波长不覆盖任何激光线。
   3. 设置 xy 分辨率。格式越大， 可提供更好的 xy 分辨率，但收集图像需要更长的时间。
   4. 设置扫描速度。较慢的扫描速度可提供较高的信噪比。但是，它也增加了像素停留时间和光漂白的风险。相应地选择。
   5. 调整针孔大小。针孔尺寸控制光学截面厚度。较小的针孔尺寸会产生更薄的光学部分，从而获得更好的 z 分辨率，但会降低荧光信号。使针孔尺寸更大可提供更厚的光学部分和更强的荧光信号。
   6. 设置激光功率、检测器/放大器增益和偏移。逐渐增加激光功率和检测器/放大器增益，直到获得合适的图像。高激光功率会带来光漂白的风险。适当调整偏移（对比度）以获得高信噪比。
   7. 根据投资回报率的大小确定所需的耕作面积。确保捕获 ROI 的整个长度和宽度。
   8. 导航所有平面中已清除的组织，并设置堆栈的起点和终点。根据所需的 z 分辨率设置 z 步长。
6. 在对图像采集设置感到满意时收集图像，并记录捕获的图像。使用图像分析软件处理图像。

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结果

使用该协议实现1mm厚度的小鼠脑切片的光学清除。 图1B 表示清除治疗前后的小鼠脑切片的传输图像。组织清除方法使1毫米厚的小鼠脑切片透明。在清除溶液中孵育12小时后，发现脑切片的最终尺寸略有扩大（线性扩张:102.5%±1.3%）。在PV-FGL小鼠的质膜中，使用靶向EGFP表达评估组织的荧光和结构完整性的保存（图1C）。在这些小鼠中，体细胞突起膜靶向EGFP在PV阳性...

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讨论

协议中的关键步骤
协议中有一些关键步骤应该非常谨慎地进行，以获得有意义的结果。样品的均匀固定对于大规模组织内的3D成像至关重要。物镜、样品和浸入液应具有匹配的 RI。它们之间的RI不匹配将导致清除的脑切片内表达EGFP的细胞的高度干扰成像（图3）。物镜对浸入液的校正环调整可最大限度地减少深度引起的球面像差，从而最大限度地提高3D成像中的信号、对...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
16x multi-immersion objective lens	Leica Microsystems	HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR
Agar	Nacalai Tesque	01028-85
Agarose	TaKaRa Bio	L03
Dimethyl sulfoxide	Nacalai Tesque	13407-45
D-Sorbitol	Nacalai Tesque	06286-55
γ-cyclodextrin	Wako Pure Chemical Industries	037-10643
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Huygens Essential	Scientific Volume Imaging	ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b
Imaris	Bitplane	ver. 9.0.0
Leica Application Suite X	Leica Microsystems	LAS X, ver. 3.5.5.19976
Methyl-β-cyclodextrin	Tokyo Chemical Industry	M1356
Paraformaldehyde	Merck Millipore	1.04005.1000
Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4)	Nacalai Tesque	27575-31	10x PBS(–)
Sodium azide	Nacalai Tesque	31233-55
Sodium pentobarbital	Kyoritsu Seiyaku	N/A
TCS SP8	Leica Microsystems	N/A
Triton X-100	Nacalai Tesque	35501-15
Urea	Nacalai Tesque	35940-65
Vibrating tissue slicer	Dosaka EM	PRO7N