用于鉴定裂殖酵母多拷贝抑制因子的遗传筛选

摘要

这项工作描述了 在Pombe裂殖酵母中进行多拷贝抑制遗传筛选的方案。该筛选使用全基因组质粒文库来鉴定与查询突变菌株相关的功能丧失表型的抑制克隆。使用该筛选鉴定 ell1 零突变体的新型遗传抑制因子。

摘要

遗传相互作用的鉴定是通过深入了解基因与其他基因的功能关系以及生物途径和过程的组织来破译基因功能的有力工具。虽然大多数遗传筛选最初是在 酿酒酵母中开发的，但 Pombe裂殖酵母提供了进行这些遗传筛选的补充平台。用于鉴定遗传相互作用的常用方法之一是在功能丧失突变体中过表达全基因组高拷贝数质粒文库中的克隆，然后选择抑制突变表型的克隆。

本文描述了一种在 庞贝链球菌中进行这种基于"多拷贝抑制"的遗传筛选的方案。该筛选有助于鉴定与 S. pombe 中缺乏 Ell1 转录伸长因子相关的遗传毒性应激敏感表型的多拷贝抑制因子。筛选是通过将查询 ell1 零突变株与高拷贝数 S. pombe cDNA质粒文库的转化并在含有4-硝基喹啉1-氧化物（4-NQO）的EMM2平板上选择抑制子（一种遗传毒性应激诱导化合物）来启动的。随后，从两个入围的抑制菌落中分离质粒，并通过限制性内切酶消化以释放插入片段DNA。释放插入片段DNA片段的质粒被重新转化为ell1缺失菌株，以确认这些抑制质粒克隆在4-NQO和其他遗传毒性化合物存在下恢复 ell1 缺失突变体生长的能力。 对那些显示缺失表型拯救的质粒进行测序，以鉴定负责抑制 ell1 缺失相关遗传毒性应激敏感表型的基因。

引言

遗传相互作用网络提供有关基因的功能信息，并描绘这些基因可能参与体内的途径和生物过程。此外，它们还可以提供不同基因如何相互作用的见解，从而产生特定的表型¹，^2，3。多年来，研究人员设计了各种基因筛选来回答基本的生物学问题和研究人类疾病。用于识别遗传相互作用的筛选可以通过多种方式进行。在不同遗传筛选中鉴定的遗传相互作用可以代表基因之间的不同机制关系。此外，研究表明，编码属于同一途径或复合物^4，5的蛋白质的基因共享一组共同的遗传相互作用。因此，遗传相互作用网络可用于在细胞中建立功能组织，其中共享最相似谱的基因属于相同的复合物或途径，那些具有不太相似的谱的基因属于相同的生物过程，并且那些表现出重叠但更多样化的谱的基因反映了属于同一细胞区室^{的成员6。}

基于剂量抑制的遗传相互作用筛选（"高拷贝或多拷贝抑制"）是常用的方法之一。这些筛选可以通过使用高拷贝数基因组或cDNA文库转化查询突变株来进行，然后使用合适的测定/选择技术来鉴定抑制或增强遗传相互作用⁷，^8，9。为了确保全面的全基因组覆盖，这些筛选还通过在全基因组功能丧失突变体集合中过表达感兴趣的特定基因或在功能丧失查询突变体中过表达高拷贝数质粒编码的基因组或cDNA文库来进行。 9，¹⁰，¹¹，12，^13，14，15.多拷贝策略也可以使用显性/过表达方法使用可调控启动子。

使用基于抑制因子的筛选的主要优点是，通过另一个基因抑制突变菌株中预先存在的表型，在这两种基因产物之间建立了遗传关系，而使用其他方法可能无法证明。其次，已经观察到预先存在的突变的存在使特定途径敏感，允许通过分离抑制因子来识别该途径的其他成分，而抑制因子可能无法通过更直接的遗传选择来识别。此外，该屏幕可用于识别具有不同抑制机制的抑制因子¹⁶。抑制因子相互作用通常发生在功能相关的基因之间，可用于阐明通路中的层次结构。抑制的确切潜在机制可能因几个因素而异，包括筛选中使用的查询突变体类型、实验条件和基因表达水平。常见的剂量抑制机制之一涉及编码在同一复合物中或在同一细胞/生物过程中并行起作用的产物的基因。在酵母等更简单的模式生物中进行这种筛选的结果可以扩展到更高的真核生物，因为大多数基本的生物途径和过程在整个进化过程中都是保守的。

这些基因筛选也可以以多种方式进行修改，以回答不同的生物学问题。例如，可以鉴定来自不同生物体的直系同源基因，这些基因可以抑制查询突变菌株的表型。它还被用于描述潜在的耐药机制并确定新型抗菌 17，¹⁸、抗真菌^19，20、抗寄生虫 21 和抗癌 ²² 化合物的蛋白质靶标。该筛选也被用于识别作用机制未知的药物活性抑制因子。因此，原则上，这些多拷贝抑制器筛可以优化并用于不同生物体的各种应用。尽管酵母研究人员采用的大多数遗传筛选最初是在酿酒酵母中开发的，但S. pombe已成为进行各种遗传筛选和测定的补充模型系统²³。此外，庞贝链球菌的基因组组织和生物学过程，例如更多基因中内含子的出现，DNA复制起源的复杂性，着丝粒结构，细胞周期的组织以及RNAi机制的存在，显示出庞贝链球菌和高等真核生物之间的更大相似性^{23，24，强调了}设计和使用庞贝链球菌遗传工具的重要性。

本文描述了一种基于S . pombe功能丧失突变表型的"剂量抑制"鉴定遗传相互作用器的协议。该协议的基础是，它是一种快速有效的方法，可以在多拷贝质粒和/或强启动子上筛选过表达野生型基因的cDNA文库。该协议有四个主要步骤:将文库转化为查询突变株，选择抑制查询突变株所需表型的质粒克隆，从这些抑制克隆中检索质粒，以及鉴定负责抑制表型的基因。与任何基于从文库中选择和鉴定cDNA的方法一样，筛选的成功取决于使用高质量和高复杂性的文库，因为筛选只能检索文库中存在的那些cDNA克隆。

使用该协议，我们成功地鉴定了查询S. pombe ell1 null突变体的遗传毒性应激敏感表型的两种新型抑制因子。ELL（十一十九赖氨酸丰富白血病）家族的转录伸长因子在体外生化测定中抑制RNA聚合酶II在DNA模板上的瞬时停顿，并且在从裂变酵母到人类的各种生物体中是保守的²⁵。早期的工作提供了证据，证明S. pombe ell1零突变体在4-硝基喹啉1-氧化物（4-NQO）和甲磺酸甲酯（MMS）存在下显示出遗传毒性应激敏感性²⁶。因此，我们将庞贝链球菌质粒编码的多拷贝cDNA文库转换为查询庞贝链球菌ell1空突变体，并鉴定了两个推定克隆，它们表现出在4-NQO（一种诱导DNA损伤的化合物）存在下抑制庞贝链球菌ell1零突变体的遗传毒性应激敏感性的能力。 对质粒克隆中存在的插入片段进行后续测序，发现编码rax2+和osh6⁺的基因在ell1无效突变体中过表达时负责抑制ell1无效突变体的遗传毒性应激敏感性。

研究方案

1. 将cDNA文库转化为查询庞 贝链球菌 突变株以筛选多拷贝抑制因子

注意:遵循标准醋酸锂方法²⁷将S. pombe cDNA文库转换为查询S. pombe ell1Δ菌株，并进行一些修改:

1. 在 YE 培养基（表 1）上以 32 °C 培养 S. pombe ell1Δ 菌株生长，该板补充有腺嘌呤、亮氨酸和尿嘧啶各 225 μg/mL。将来自上述平板的 ell1Δ 菌株接种在 15-20 mL 的 YE 培养基中，接种各补充有腺嘌呤、亮氨酸和尿嘧啶各 225 μg/mL 的 YE 培养基。在32°C振荡（200-250rpm）孵育过夜。
2. 第二天，将过夜培养物稀释在100mL新鲜YE培养基中，并添加所需添加剂至OD 600nm（600nm处的光密度）为0.3，并在32°C下以200-250rpm振荡孵育，直到OD_600nm达到中间对数期。
3. 将 100 mL 培养物分成两个 50 mL 离心管，然后在室温下以 4，000 × g 离心 10 分钟。
4. 弃去上清液并用1mL无菌水洗涤细胞沉淀，即将细胞重悬于1mL无菌水中，并在室温下以4，000× g 离心5分钟。
5. 弃去上清液，并用1mL的1x LiAc-TE（100mM乙酸锂，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.5）溶液洗涤每个细胞沉淀，如步骤1.4中所述。
6. 取出上清液并将每个细胞沉淀重悬于 250 μL 1x LiAc-TE 中。使用这些 庞贝链球菌 感受态细胞（500μL）与感兴趣的DNA进行转化。将 125 μL 感受态细胞转移到四个不同的无菌微量离心管中，用于后续转化步骤。
7. 将鲑鱼睾丸或鲱鱼精子的载体DNA煮沸1分钟，然后立即放在冰上。对于每次转化，将 10 μL 10 mg/mL 变性单链载体 DNA 加入含有 125 μL 感受态细胞的微量离心管中，然后使用微量移液器吸头轻轻混合。随后，将50μg庞 贝链球菌 cDNA文库添加到含有感受态细胞 - 载体DNA混合物的微量离心管中。
8. 将微量离心管在室温下孵育10分钟，然后加入260μL聚乙二醇-醋酸锂溶液（40%[w / v] PEG 4，000，100mM乙酸锂，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.5）并借助微量移液器吸头轻轻混合。
9. 将含有转化混合物的微量离心管在32°C孵育2小时而不摇动。向微量离心管中加入 43 μL 预热的二甲基亚砜 （DMSO） 并轻轻混合。随后，将管暴露在42°C的热冲击下5分钟。
10. 在室温下以4，000× g 沉淀细胞5分钟。弃去上清液，并在微量移液器吸头的帮助下除去残留的PEG-LiAc-TE溶液。
11. 将细胞重悬于100μL无菌水中，并用所需的补充剂和0.2μg/ mL的4-NQO在一个EMM2（表1）板（150mm）上平板上。
12. 将板在32°C孵育5-6天，以使菌落出现在板上。在 0.2 μg/mL 4-NQO 存在下，将获得的菌落划线在同一培养基板上，并用于进一步筛选。
13. 对于一个文库转化实验，如上述步骤1.8至1.14所述，使用500 μL感受态细胞（125 μL感受态细胞x 4个微量离心管）进行转化。
14. 作为对照，将转化混合物的1/10放在一个EMM2板（150mm）上，并添加所需的补充剂，但缺少4-NQO，以计算转化文库后获得的文库克隆总数，并筛选抑制器^{克隆的分离} 。

2. 通过推定抑制因子测试和验证与查询突变菌株相关的表型的拯救/抑制

注意:应力点测定如下所述进行，以测试和验证推定抑制器对 ell1 缺失相关4-NQO应力敏感性的拯救/抑制。

1. 在无菌 96 孔微量滴定板的每个不同孔中加入 100-200 μL 无菌水。
2. 使用无菌牙签或 20-200 μL 微量移液器吸头，从含有 4-NQO 的平板上 cDNA 文库转化后获得的每个不同菌落中挑选少量接种物。将来自每个不同菌落的接种物添加到含有100-200μL无菌水的微量滴定板的单独独立孔中。充分混合。
3. 将每个孔中的 3 μL 细胞悬液点到含有腺嘌呤 （225 μg/mL） 和尿嘧啶 （225 μg/mL） 但缺乏亮氨酸（用于构建本文所用文库的质粒载体上存在的选择性营养标志物）的 EMM2 琼脂平板上。根据需要向板中加入适当浓度的4-NQO。
4. 将板在32°C孵育3-4天以使细胞生长。确定在不同浓度的4-NQO作为推定抑制因子存在下显示生长的菌落。
5. 为了进一步验证抑制器，在含有腺嘌呤和尿嘧啶各225μg/ mL但缺乏亮氨酸的EMM2培养基中振荡（200-250rpm）在32°C下将选定的抑制子与适当的对照菌株一起生长过夜。
6. 第二天，在新鲜的EMM2培养基中将细胞稀释至OD 600nm的0.3，并在32°C下振荡直至对数中期（约OD_600nm为0.6-0.8）。
7. 在含有 0.4 μM 4-NQO 或 0.01% MMS 的所需补充剂的 EMM2 平板上发现适当的连续稀释（1:10 或 1:5）培养物。为了控制，在EMM2平板上发现菌株，并添加所需的补充剂，但缺乏任何DNA损伤剂。
8. 将板在32°C孵育3-5天以监测生长。
   注意:应使用基于与查询突变菌株相关的表型的合适测定来测试表型的挽救或抑制。例如，如果需要鉴定查询突变菌株的冷敏表型的抑制子，则用于测试和验证抑制子克隆的测定将涉及在低温下生长转化体。
9. 发现用全长目的基因（在本例中为 Spell1 ）或空载体转化的突变菌株分别作为阳性和阴性对照，以及文库转化体。

3. 从 庞贝链球菌 抑制克隆中分离质粒

注意:从 S. pombe 中分离质粒是按照裂变酵母:实验室手册²⁸ 中描述的方案进行的，并进行了一些修改。

1. 在含有225μg/ mL腺嘌呤和尿嘧啶的EMM 2培养基中接种单个酵母菌落，并在32°C下以200-250rpm振荡孵育细胞过夜。第二天，通过在室温下以4，000× g 离心2分钟收获5个外径细胞（即10mL外径0.5培养物）。
2. 除去上清液并将细胞沉淀重悬于 0.2 mL 裂解缓冲液（2% Triton X-100、1% SDS、100 mM NaCl、10 mM Tris_HCl（pH 8.0） 和 1 mM Na 2 EDTA）中。
3. 向微量离心管中加入0.2mL苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）和0.3g酸洗玻璃珠。在4°C下涡旋微量离心管2分钟，并在冰上孵育1分钟。重复此步骤 6 次。
4. 在室温下以10，000× g 离心管15分钟。将上层水层转移到新鲜的微量离心管中，并加入 200 μL 苯酚:氯仿:异戊醇 （25:24:1）。
5. 将管以10，000× g 离心10分钟。将上层水层转移到新管中，并向管中加入两体积的100%乙醇（~400μL）和1/10体积的乙酸钠（3M，pH 5.8）（~20μL）。将微量离心管-70°C孵育1小时。
6. 通过在4°C下以10，000× g 离心15分钟沉淀DNA，并除去上清液。用70%乙醇（~500μL）洗涤DNA沉淀，并保持室温风干。
7. 将 DNA 重悬于 20 μL 无菌水中。使用 2-5 μL 质粒 DNA 转化感受态 大肠杆菌 细胞。
   注意:质粒也可以使用任何市售的酵母质粒分离试剂盒从酵母细胞中分离出来。

4. 抑制克隆编码基因的鉴定

1. 使用标准方案²⁹ 将分离的酵母质粒转化为大肠杆菌 Top10 菌株 [F-mcrA （mrr-hsdRMS-mcrBC） 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 （ara-leu）7697 galUgalKrpsL （StrR） endA1 nupG]，并使用所需的抗生素将细胞散布在 LB（Luria 肉汤）平板上。
2. 使用标准碱裂解方案²⁹从大肠杆菌转化体中分离质粒，并遵循限制性内切酶的适当组合以检查通过限制性酶切释放插入的DNA片段。
   注意:抑制质粒84用 BamHI限制性内切酶解，抑制质粒104用 PstI / BamHI限制性内切酶解。
3. 在 ell1Δ 菌株中限制性酶切后显示插入片段释放的质粒重新转化，以检查它们拯救 ell1Δ 菌株的遗传毒性应激敏感表型的能力。
4. 选择显示抑制遗传毒性应激敏感性的质粒克隆，并使用载体特异性正向和反向引物对这些质粒克隆中存在的插入片段DNA片段进行测序。
   注意:在本研究中，使用了 adh1 启动子特异性通用正向引物（5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3'）³⁰。
5. 为了鉴定负责抑制的基因，请对齐使用NCBI核苷酸原始细胞（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch）或Pombase序列比对工具（https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core）获得的序列。选择显示最大比对的序列，并将其鉴定为多拷贝抑制质粒的基因。

结果

筛选 ell1 缺失相关遗传毒性应激敏感性 的多拷贝抑制因子
我们使用上述协议进行了遗传筛选，以鉴定查询ell1缺失突变株的功能丧失表型的多拷贝抑制因子。在4-NQO基因毒性剂存在下观察到的ell1缺失菌株的生长相关敏感性被采用为功能丧失表型来选择多拷贝抑制因子。图1显示了遗传筛选的示?...

讨论

酵母已被广泛用于研究在真核生物中进化上保守的基本生物过程和途径。遗传和基因组工具的可用性以及它们对各种生化，遗传和分子程序的适应性使酵母成为遗传研究的优秀模式生物³⁴，^35，36。多年来，酵母研究人员已经设计了各种遗传筛选来识别遗传相互作用，这些相互作用将揭示单个基因的功能，以及它们可能参与的途...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-NQO	Sigma	N8141
Acetic Acid, glacial	Sigma	1371301000
Adenine Sulphate	Himedia	GRM033
Agar	Himedia	GRM026
Agarose	Lonza	50004L
Ammonium Chloride	Himedia	MB054
BamHI	Fermentas	ER0051
Biotin	Himedia	RM095
Boric Acid	Himedia	MB007
Calcium Chloride	Sigma	C4901
Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1	Sigma	C0549
Citric Acid	Himedia	RM1023
Disodium hydrogen phospahte anhydrous	Himedia	GRM3960
single stranded DNA from Salmon testes	Sigma	D7656
EDTA disodium	Sigma	324503
Ferric Chloride Hexahydrate	Himedia	RM6353
Glucose	Amresco	188
Ionositol	Himedia	GRM102
Isopropanol	Qualigen	Q26897
Leucine	Himedia	GRM054
Lithium Acetatae	Sigma	517992
Magnesium Chloride Hexahydrate	Himedia	MB040
Molybdic Acid	Himedia	RM690
Nicotinic Acid	Himedia	CMS177
PEG, MW 4000	Sigma	81240
Pentothinic Acid	Himedia	TC159
Phenol	Himedia	MB082
Plasmid Extraction Kit	Qiagen	27104
Potassium Chloride	Sigma	P9541
Potassium hydrogen Pthallate	Merc	DDD7D670815
Potassium iodide	Himedia	RM1086
RNAse	Fermentas	EN0531
SDS	Himedia	GRM205
Sodium Hydroxide	Himedia	GRM1183
Sodium Sulphate	Himedia	RM1037
Tris free Base	Himedia	MB209
Uracil	Himedia	GRM264
Yeast Extract Powder	Himedia	RM668
Zinc Sulphate Heptahydrate	Merc	DJ9D692580