相干反斯托克斯拉曼光谱（CARS）在脑切片中成像髓鞘形成的应用

摘要

可视化髓鞘形成是许多研究神经系统的研究人员的重要目标。CARS是一种与免疫荧光兼容的技术，可以对组织内的脂质进行天然成像，例如大脑，照亮髓磷脂等特殊结构。

摘要

相干反斯托克斯拉曼光谱（CARS）是化学家和物理学家经典采用的一种技术，用于产生分子特征振动的相干信号。然而，这些振动特征也是解剖组织（如大脑）内分子的特征，使其越来越有用和适用于神经科学应用。例如，CARS可以通过特异性激发这些分子内的化学键来测量脂质，从而可以量化组织的不同方面，例如参与神经传递的髓磷脂。此外，与通常用于定量髓磷脂的其他技术相比，CARS还可以设置为与免疫荧光技术兼容，允许与其他标记物（如钠通道或突触传递的其他成分）共同标记。髓鞘形成变化是脱髓鞘疾病（如多发性硬化症）或其他神经系统疾病（如脆性X综合征或自闭症谱系障碍）的固有重要机制，是一个新兴的研究领域。总之，CARS可以以创新的方式用于回答神经科学中的紧迫问题，并为与许多不同神经系统疾病相关的潜在机制提供证据。

引言

动作电位是大脑中信息的基本单位，通过轴突传播的动作电位构成了^{信息处理的}支柱1，^2，3。神经元通常接收来自多个其他神经元的传入输入，并在给定的狭窄时间窗口^4，5内整合这些输入。因此，轴突中作用电位传播的机制受到了研究者的极大关注。

当通过轴突传播时，动作电位沿轴突反复再生，以确保可靠的传播⁶。在颌脊椎动物（gnathostomes）的大多数神经元中，轴突被髓磷脂鞘包围，髓鞘是由附近的少突胶质细胞或雪旺细胞产生的富含脂质的物质，这是神经胶质细胞的类型（回顾于^7，8）。这种髓鞘对轴突进行电绝缘，降低其电容，并允许动作电位高效、快速且能耗更低。髓磷脂不能均匀地覆盖轴突，但它将轴突包裹在它们之间有短间隙的段中，称为Ranvier的节点（在^9，10中回顾）。控制轴突电绝缘水平的髓鞘厚度和控制动作电位沿轴突再生....

研究方案

所有实验均符合所有适用法律、美国国立卫生研究院指南，并已获得科罗拉多大学安舒茨机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 动物

1. 使用从杰克逊实验室获得的C57BL / 6J（股票#000664）小鼠（Mus musculus ）或最初从查尔斯河获得的蒙古沙鼠（Meriones unguiculatus）。

2. 组织准备

1. 对于经心灌注，用戊巴比妥（120 mg/kg体重）过量，并经心灌注磷酸盐缓冲盐水（PBS;137 mM NaCl，2.7 mM KCl，1.76 mM KH 2 PO 4，10 mM Na₂HPO 4），然后用₄%多聚甲醛（PFA）²⁴。
   1. 具体来说，用剪刀打开腹部和肋骨，并用凯利止血钳将肋骨固定到位，露出心脏。
   2. 将连接到灌注泵的 23 GA 针插入左心室，并使用细剪刀快速切割右心房。
   3. 通过灌注泵和心脏中的针头施用PBS10分钟，以清除大脑和体内的血液。
   4. 将灌注泵切换到4%PFA10分钟，并检查四肢和尾巴的硬度以确认成功灌注。

结果

与其他技术相比，CARS显微镜的最大优势之一是与荧光成像的兼容性²³。 图1 显示了CARS光谱与用免疫荧光标记标记的Nissl相比，光谱几乎没有重叠。 图2 显示了结合共聚焦显微镜的CARS激光设置。 图3 显示了两个代表性图像，一个是单个堆栈，另一个是来自沙鼠和小鼠的z-stack最大投影，可以使用显示细胞体（青色?.......

讨论

越来越多的文献强调髓磷脂在大脑功能中的作用¹³，¹⁶，^21，28。此外，我们知道髓鞘厚度和髓鞘形成模式可以在多种神经系统疾病中发生变化，例如多发性硬化症（²⁹ 年回顾）、衰老（30 年回顾）、自闭症^20、31 等。因此?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic:
1 mL disposable syringe with needle 27 GA x 0.5"	Exel int	260040
Fatal +	Vortech
Surgery:
Spring Scissors - 8mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15024-10
Standard tweezers	Fine Science Tools	11027-12
Perfusion:
4% Paraformaldehyde	Fisher Chemical	SF994 (CS)
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14063-11
Kelly hemostats	Fine Science Tools	13019-14
Millipore H2O
Needle tip, 23 GA x 1"	BD precision glide	305193
Phosphate buffered saline (PBS):
Potassium chloride	Sigma	P9333
Potassium phosphate monobase	Sigma	P5655
pump with variable flow or equivalent
Sodium chloride	Fisher Chemical	s271-1
Sodiumphosphate dibasic	Sigma	S7907
Dissection:
50 mL vial with 4% PFA
Bochem Chemical Spoon 180mm	Bochem	230331000
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14063-11
Noyes Spring Scissors	Fine Science Tools	15011-12
Pair of fine (Graefe) tweezers	Fine Science Tools	11050-10
Shallow glass or plastic tray, approximately 10" x 10"
Standard tweezers	Fine Science Tools	11027-12
Surgical Scissors - Blunt	Fine Science Tools	14000-20
Slicing:
Agar, plant	RPI	9002-18-0
Vibratome	Leica	VT1000s
well plate	Alkali Sci.	TPN1048-NT
Staining:
AB Media:			1n 1,000 mL of Millipore H2O
Phosphate buffered (PB):
Potassium Phosphate Monobase	Sigma	P5655
Sodium Phosohate Dibasic	Sigma	S7907
BSA (Bovine serum albumin)	Sigma life science	A2153-100g
Sodium Chloride	Fisher Chemical	s271-1
Triton X-100	Sigma - Aldrich	x100-500ml
Nissl 435/455	Invitrogen	N21479
CARS:
APE picoemerald laser	Angewandte Physik & Elektronik GmbH
bandpass filter (420-520 nm)	Chroma Technology	HQ470/100m-2P
bandpass filter (500-530 nm)	Chroma Technology	HQ515/30m-2P
bandpass filters (640-680 nm)	Chroma Technology	HQ660/40m-2P
Confocal microscope	Olympus	FV1000
Cut Transfer pipet	Fisher	13-711-7M
dichroic longpass 565 nm	Chroma Technology	565dcxr
dichroic longpass 585 nm	Chroma Technology	585dcxr
dichroic shortpass 750 nm	Chroma Technology	T750spxrxt
glass bottom culture dish	MatTek	P35G-0-10-C
glass weight (10 mm x 10 mm boro rod)	Allen Scientific Glass Inc
multiphoton shortpass emission filter 680 nm	Chroma Technology	ET680sp-2p8
PBS