In This Article

Summary

该协议详细概述了使用两种用于冷冻TEM网格的样品制备方法制备核小体复合物。

Abstract

染色质背景下的DNA修复知之甚少。使用核小体核心颗粒（染色质的基本重复单位）的生化研究表明，与游离DNA相比，大多数DNA修复酶以较低的速率去除DNA损伤。关于碱基切除修复（BER）酶如何识别和去除核小体中DNA损伤的分子细节尚未阐明。然而，核小体底物的生化BER数据表明，核小体根据DNA病变和酶的位置呈现出不同的结构屏障。这表明这些酶用于去除游离DNA中DNA损伤的机制可能与核小体中使用的机制不同。鉴于大多数基因组DNA组装成核小体，需要这些复合物的结构信息。迄今为止，科学界缺乏详细的协议来对这些复合物进行技术上可行的结构研究。在这里，我们提供了两种方法来制备两种基因融合的BER酶（聚合酶β和AP核酸内切酶1）的复合物，结合到核小体入口 - 出口附近的单核苷酸间隙，用于冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构测定。两种样品制备方法都兼容通过冷冻 对 优质网格进行玻璃化处理。该协议可用作制备具有不同BER因子，先驱转录因子和染色质修饰酶的其他核小体复合物的起点。

Introduction

真核DNA由组蛋白组织和压缩，形成染色质。核小体核心颗粒（NCP）构成了染色质的基本重复单元，其调节DNA结合蛋白的可及性，以进行DNA修复，转录和复制1。尽管NCP的第一个X射线晶体结构在二十多年前首次被解决2，并且自3，4，5，6以来已经发表了更多的NCP结构，但核小体底物中的DNA修复机制尚未被描绘出来。揭示染色质中DNA修复的分子细节将需要对参与组分进行结构表征，以了解NCP的局部结构特征如何调节DNA修复活动。这在碱基切除修复（BER）的背景下尤其重要，因为BER酶的生化研究表明核小体中独特的DNA修复机制取决于催化的酶特异性结构要求和核小体内DNA病变的结构位置7，8，9，10，11，12，13.鉴于BER是一个至关重要的DNA修复过程，人们非常有兴趣填补这些空白，同时也建立一个起点，从中可以进行涉及相关核小体复合物的其他技术上可行的结构研究。

冷冻电镜正迅速成为解决复合物三维 （3D） 结构的首选方法，其大规模制备均质样品具有挑战性。尽管与DNA修复因子（NCP-DRF）复合的NCP的设计和纯化可能需要量身定制的优化，但此处介绍的生成和冷冻稳定的NCP-DRF复合物的程序提供了有关如何优化样品和冷冻电镜网格制备的详细信息。 图 1 中所示的两个工作流（不相互排斥）以及协议中的特定详细信息确定了关键步骤，并提供了优化这些步骤的策略。这项工作将推动染色质和DNA修复领域朝着一个方向发展，即用结构研究补充生化在技术上变得可行，以更好地了解核小体DNA修复的分子机制。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. 通过盐渍透析组装核小体核心颗粒

注意:使用重组组蛋白进行结构研究的核小体核心颗粒的制备已被其他人详细详细描述14，15，16。按照其他人14，15描述的重组X. laevis组蛋白和组蛋白八聚体组装的纯化，并如下所述组装核小体底物。

  1. 以指示的规模购买三种寡核苷酸（如 表1所列）:UND-197mer，161mer，35mer。
    1. PAGE纯化超聚体（197mer和161mer），如所述17。
      1. 在1x退火缓冲液（10mM Tris-Cl，pH 8.0，50mM NaCl）中等摩尔量的寡核苷酸退火。例如，混合 40 μL 161-mer [166.7 μM];8 μL 35-mer [292.4 μM];16.8 μL 197-mer 复合链 [408.2 μM];10 μL 10x 退火缓冲液和 10.9 μL dH2O。
        注意:用温度梯度控制退火反应至关重要。有关温度梯度的详细信息，请参见 表2 。
  2. 进行小规模重构（最终体积为50μL，按以下示例的1/57倍进行缩放）以确定DNA与组蛋白八聚体的比例（DNA:ocumer的典型起始比例如下:1:0.9，1:1.1，1:1.2，1:2; 如图2A所示）;通过小规模重构根据经验确定该比率至关重要。
    1. 确定该比例后，准备大规模重组。例如，混合 32.9 μL DNA-197 bp [99.4 μM];1647.1 μL TE （1x）;1120 μL 5 M NaCl 和 62.3 μL WT 组蛋白八聚体 [2.56 μM]。
  3. 使透析缓冲液:RB低 和RB高 ，分别如表 3 和 表4所述;如前所述设置重构14.
    1. 将透析管转移到含有RB高的烧杯中，并允许透析在轻轻搅拌下进行16小时或直到2LRB低 转移到废烧杯中。
  4. 将透析管转移到含有RB50mM 缓冲液的1L烧杯中（表5），并使样品透析至少3小时或过夜。
    1. 评估 6% 聚丙烯酰胺非变性凝胶的复溶效率，确保游离 DNA 和单个 NCP 条带少于 10%;将NCP储存在4°C。 参见图 2A （泳道5）和 图2B ，了解代表性的最佳复溶结果。

2. 制备 NCP-DNA 修复因子复合物 （NCP-DRF）

  1. 通过制备型凝胶电泳纯化
    注意:这种方法是最劳动密集型的（在所描述的两种方法中），虽然它可以有效地去除高分子量（HMW）物质（图 6A） 由于稀释系数高，可能导致一些拆卸，如 图7A （NCP制备细胞出泳道），释放DNA。然而，高达25%的游离DNA仍然与冷冻电镜研究兼容。由于高稀释度，使用此方法仅纯化NCP，而不是整个复合物。
    1. 在0.2x TBE中制备70mL的6%非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液，使用聚丙烯酰胺凝胶溶液37.5:1，丙烯酰胺:双丙烯酰胺。倒入外半径为28毫米的圆柱形凝胶并聚合过夜。
    2. 组装制备凝胶电泳装置，使用截止值为6-8kDaMW的透析膜。使用0.25x TBE作为电泳缓冲液和1x洗脱缓冲液（50 mM KCl，10 mM HEPES，pH 7.5）。以恒定的12 W预运行圆柱形凝胶1小时，并收集以约1 mL / min的流速运行蠕动泵的级分。
      注意:如果没有紫外检测器来鉴定含有DNA的馏分，则可以使用 32P-NCP进行筛选实验以鉴定感兴趣的馏分。在所有条件保持不变的情况下，无需紫外线检测器即可纯化未标记的NCP。
    3. 使用离心过滤器（MW 截止值 30 kDa）将 2.8 mL NCP 浓缩至 250 μL，并加载到制备型凝胶和电泳上总共 6 小时。在2小时，当二甲苯氰从凝胶中用完时，开始收集1.5mL级分。
      注意:在2.5小时，馏分将不含二甲苯氰;DNA（197mer）在大约3-3.5小时洗脱，NCP预计在4.5-5小时标记处洗脱。
    4. 分析6%非变性聚丙烯酰胺凝胶上的目标级分。汇集含有NCP的馏分，并立即用离心过滤器（MW截止值30 kDa）浓缩至1 mg/mL。第二天，在与感兴趣的DNA修复因子（DRF）络合之前，在6%聚丙烯酰胺非变性凝胶上评估NCP的质量。
    5. 使用特定复合物的最佳缓冲液在冰上孵育NCP和感兴趣的DRF15分钟。例如，混合 1，000 μL NCP [1.2 μM];260 μL 5x 结合缓冲液（250 mM HEPES，pH 8、500 mM KCl、25 mM MgCl2）、22 μL 3 M KCl 和 18 μL MBP- Pol β-APE1 [338 μM]。
      注意:制备络合物的温度和离子强度可能需要针对不同的络合物进行优化。
    6. 加入戊二醛（新鲜打开;EM级）至终浓度为0.005%。因此，向该反应中加入26.8μL的0.25%戊二醛和13.2μL的dH2O.充分混合，并在室温下孵育13分钟。
    7. 用 1 M Tris-Cl，pH 7.5 淬灭至终浓度为 20 mM Tris-Cl，pH 7.5。浓缩至~50μL，并使用脱盐柱用1x冷冻缓冲液交换缓冲液:50 mM KCl，10 mM HEPES，pH 7.5。
      注意:戊二醛会导致严重的皮肤灼伤和眼睛损伤;吞咽有害，吸入有毒。穿上实验室外套、护目镜、手套，在通风橱中处理戊二醛，并戴上口罩。
      注意:在此较低浓度下与NCP进行大体积交联反应至关重要。先前的交联尝试，即使在这种浓度的戊二醛下，但在浓度高10倍的NCP下，也会导致样品聚集和过度交联，如SDS PAGE和尺寸排阻色谱所示。这些网格没有可识别的颗粒，只有团块（图5D，E）。
    8. 确定OD 280和OD260处的吸光度，如果需要，根据OD280进一步浓缩以达到1.3-3mg / mL（OD260 / OD280= 1.7-2的典型比率产生良好颗粒）。对于这种 50 μL 的小体积，减少样品损失的最佳方法是制作一个透析按钮，其盖子为 1.7 mL 管，由透析膜（6-8 kDa MW 截止值）覆盖，切割管底部并使用管的边缘将膜密封在盖子顶部。
    9. 将含有样品的透析按钮放在聚乙二醇床的顶部，膜朝下（每2分钟检查一次进度）。当所需浓度小于或等于2.5倍时，首选此方法，以避免稀释或丢失浓缩器中的样品。在此步骤之后立即准备复合物的冷冻电镜网格至关重要。
  2. 体积排阻色谱纯化
    1. 冷冻前一天，洗涤并用60 mL dH2O的体积排阻柱，然后以0.4 mL / min的速度将80 mL冷冻缓冲液（50 mM KCl，10 mM HEPES，pH 8）平衡过夜。复溶后直接使用 NCP，使用 2.5 倍以上的量制备相同的复合物，如下所示:混合 2，500 μL NCP [1.2 μM];650 μL 5x 结合缓冲液;45 μL MBP-Pol β-APE1 [338 μM] 和 55 μL 3M KCl。
    2. 将混合物在没有交联剂的冰上孵育15分钟。然后，按照制备凝胶法所述，加入戊二醛至终浓度为0.005%。然而，在这种情况下，将复合物浓缩在预平衡（带冷冻缓冲液）离心过滤器中至约120μL。
    3. 如前所述，立即分析峰级分并浓缩含有组蛋白和MBP-Pol β-APE1的馏分。使用尺寸排除方法的成功结果见图5A，B，C，图7。

3. 冷冻核小体复合物

  1. 打开跳水式冰箱并用 50 mL dH2O 填充加湿器后，将腔室温度设置为 22 °C，将 HR （湿度）设置为 98%。将乙烷杯和液氮杯（包含标记的网格盒）放在各自的空间支架中。
  2. 用乙烷盖分配器盖住乙烷杯，小心地将液氮 （LN2） 倒在其上，同时用 LN 2 填充 LN2 杯。当LN2水平稳定并达到100%和-180°C温度时，小心地打开乙烷阀并填充乙烷杯，直到它在透明盖上形成气泡。取下乙烷分配器。
  3. 将两张滤纸放在印迹设备上，并用金属环固定。转到设置并使用以下参数进行印迹:0 印迹前、3 秒印迹、0 印后;选择" 暴跌 "，然后单击 "确定"。
  4. 在主屏幕上，单击 加载镊子，然后用碳/应用侧朝左的网格加载它们（像以前一样准备）。校准镊子，调整Z轴以确保固体印迹。单击 下室 并应用 3 μL 复合物（1.3-3 mg/mL;OD280）。点击 印迹/暴跌。这将旋转网格以从正面印迹，并将其冻结。
  5. 将网格转移并存储在 LN2 腔室的网格盒中。当所有四个网格都已冻结并放置在网格盒中时，将盖子旋转到中性位置，其中所有网格都被盖子覆盖，然后拧紧螺钉。网格可以存储在LN2 中，直到开始筛选。

4. 屏幕网格

  1. 在将样品装入显微镜之前，将玻璃化网格放在环上并使用C形夹固定它们。在湿度受控的房间内在LN2 下执行此剪切过程，以避免冰污染。
  2. 加载显微镜时，将网格插入12槽盒中。将盒式磁带穿梭到纳米驾驶室胶囊中，然后将其装入自动装载机。自动装载机机器人机构启动该过程。
  3. 将网格从暗盒转移到显微镜载物台。通过将载物台摆动10°并同时移动Z高度，直到在图像中观察到最小的平面偏移，将载物台调整到真心高度。
  4. 一旦达到真心高度，就开始成像。首先，通过拍摄网格的 3 x 3 蒙太奇图像来获取图集，其中每个蒙太奇都以 62 倍放大倍率拍摄。选择三个不同大小的正方形;取以真心高度，然后在210倍放大倍率下成像。
  5. 对正方形进行成像后，从正方形内的边缘、中心和中间各选择一个孔。以 2600 倍放大倍率对每个孔进行成像。
  6. 在拍摄此高放大倍率图像之前，自动对焦发生在成像区域的偏移处。以 36，000 倍放大倍率和 7.1 秒曝光时间、60 帧、1.18 像素尺寸和 3 μm 散焦从孔中心拍摄高放大倍率图像。参见图 5、 图6和图7中的代表性筛选图像。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

正确组装的NCP（图2）用于与MBP-Polβ-APE1的重组融合蛋白制备复合物（图3）。为了确定NCP与MBP-Polβ-APE1形成稳定复合物的比例，我们进行了电泳迁移率位移测定（EMSA）（图4），该测定显示NCP的单移带与5倍摩尔过量的MBP-Polβ-APE1。在优化制造这种复合物的过程中，与戊二醛交联对于防止NCP分崩离析至关重要。最初，NCP-Polβ-APE1复合物...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

纯化DNA修复因子的特定方案将取决于感兴趣的酶。然而，有一些一般性建议，包括使用重组方法进行蛋白表达和纯化18;如果感兴趣的蛋白质太小（<50 kDa），则通过冷冻电镜进行结构测定几乎是不可能的，直到最近通过使用融合系统19，纳米抗体结合支架20和优化成像策略21。

在初始阶段获得劣质网格是很?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

作者声明没有竞争利益。

Acknowledgements

我们感谢美国国家环境健康科学研究所冷冻电镜核心的Mario Borgnia博士和北卡罗来纳大学教堂山分校的Joshua Strauss博士在冷冻电镜网格制备方面的指导和培训。我们还感谢朱莉安娜·梅洛·达丰塞卡·雷赞德博士在该项目初期提供的技术援助。我们感谢已故Samuel H. Wilson博士及其实验室成员，特别是Rajendra Prasad博士和Joonas Jamsen博士对纯化基因融合的APE1-Polβ复合物的重要贡献和支持。该研究得到了美国国立卫生研究院，国家环境健康科学研究所的校内研究计划[批准号Z01ES050158，Z01ES050159和K99ES031662-01]的支持。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 M HEPES; pH 7.5Thermo Fisher Scientific15630080
1 M MgCl2Thermo Fisher ScientificAM9530G
10x TBEBio-rad1610733
25% glutaraldehydeFisher Scientific50-262-23
3 M KClThermo Fisher Scientific043398.K2
491 prep cellBio-rad1702926
Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)Millipore SigmaZ717185
Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)Millipore SigmaUFC8030
AutoGrid TweezersTed Pella47000-600
Automatic Plunge FreezerLeicaLeica EM GP
C-1000 touch thermocyclerBio-rad1851148
C-clips and ringsThermo Fisher6640--6640
Clipping stationSubAngostromSCT08
Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa)Fisher Scientific15370752
Diamond TweezersTechni-Pro758TW0010
dsDNAIntegrated DNA techonologiesN/A
FEI Titan KriosThermo FisherKRIOSG4TEM
FPLC purification systemAKTA Pure29018224
Fraction collector Model 2110Bio-rad7318122
Glow Discharge Cleaning SystemTed Pella91000S
Grid BoxesSubAngostromPB-E
Grid Storage Accessory PackSubAngostromGSAX
Liquid EthaneN/AN/A
Liquid NitrogenN/AN/A
Minipuls 3 peristaltic two-head pumpGilsonF155008
NanodropThermo Fisher ScientificND-2000
Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein GelsThermo Fisher ScientificEC6695BOX
PipetmanGilsonFA10002M
Pipette tips (VWR) Low RetentionVWR76322-528
Polyacrylamide gel solution (37.5:1)Bio-rad1610158
polyethylene glycol (PEG)Millipore SigmaP4338-500G
Pur-A-lyzer Maxi 3500Millipore SigmaPURX35050
Purified recombinant DNA repair factorN/AN/A
R 1.2/1.3 Cu 300 mesh GridsQuantifoilN1-C14nCu30-01
Recombinant histone octamerN/AN/A
Spring clipping toolsSubAngostromCSA-01
Superdex 200 column 10/300Millipore SigmaGE28-9909-44
Transmission Electron MicroscopeThermo FisherTalos Arctica 200 kV
Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-ITed Pella47000-500
UltraPure GlycerolThermo Fisher Scientific15514011
VitrobotThermo FisherMark IV System
Whatman Filter paper (55 mM)Cytiva1005-055
Xylene cyanolThermo Fisher Scientific440700500
Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µLThermo Fisher Scientific89877

References

  1. Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution. Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).
  4. Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z. Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).
  5. Tachiwana, H., et al. Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A. Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).
  6. McGinty, R. K., Tan, S. Nucleosome structure and function. Chemical Reviews. 115 (6), 2255-2273 (2015).
  7. Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).
  8. Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair. DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).
  9. Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles. Biochemistry. 58 (35), 3646-3655 (2019).
  10. Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).
  11. Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).
  12. Olmon, E. D., Delaney, S. Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA. ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).
  13. Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. Rules of engagement for base excision repair in chromatin. Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).
  14. Dyer, P. N., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
  15. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).
  16. McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes. Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).
  17. Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).
  18. Burgess, R. R. D., Murray, P. Guide to Protein Purification. 463, Academic Press. (2009).
  19. Coscia, F., et al. Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein. Scientific Reports. 6, 30909(2016).
  20. Wu, X., Rapoport, T. A. Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies). Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118(2021).
  21. Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032(2019).
  22. Takizawa, Y., et al. Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence. Open Biology. 8 (3), 170255(2018).
  23. Anderson, C. J., et al. Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase. Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

186