制备与DNA修复因子络合的核小体核心颗粒用于冷冻电镜结构测定

摘要

该协议详细概述了使用两种用于冷冻TEM网格的样品制备方法制备核小体复合物。

摘要

染色质背景下的DNA修复知之甚少。使用核小体核心颗粒（染色质的基本重复单位）的生化研究表明，与游离DNA相比，大多数DNA修复酶以较低的速率去除DNA损伤。关于碱基切除修复（BER）酶如何识别和去除核小体中DNA损伤的分子细节尚未阐明。然而，核小体底物的生化BER数据表明，核小体根据DNA病变和酶的位置呈现出不同的结构屏障。这表明这些酶用于去除游离DNA中DNA损伤的机制可能与核小体中使用的机制不同。鉴于大多数基因组DNA组装成核小体，需要这些复合物的结构信息。迄今为止，科学界缺乏详细的协议来对这些复合物进行技术上可行的结构研究。在这里，我们提供了两种方法来制备两种基因融合的BER酶（聚合酶β和AP核酸内切酶1）的复合物，结合到核小体入口 - 出口附近的单核苷酸间隙，用于冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构测定。两种样品制备方法都兼容通过冷冻 对 优质网格进行玻璃化处理。该协议可用作制备具有不同BER因子，先驱转录因子和染色质修饰酶的其他核小体复合物的起点。

引言

真核DNA由组蛋白组织和压缩，形成染色质。核小体核心颗粒（NCP）构成了染色质的基本重复单元，其调节DNA结合蛋白的可及性，以进行DNA修复，转录和复制¹。尽管NCP的第一个X射线晶体结构在二^{十多年前首次}被解决2，并且自³，⁴，⁵，⁶以来已经发表了更多的NCP结构^，但核小体底物中的DNA修复机制尚未被描绘出来。揭示染色质中DNA修复的分子细节将需要对参与组分进行结构表征，以了解NCP的局部结构特征如何调节DNA修复活动。这在碱基切除修复（BER）的背景下尤其重要，因为BER酶的生化研究表明核小体中独特的DNA修复机制取决于催化的酶特异性结构要求和^核小体内DNA病变的结构位置7，⁸，⁹，10，¹¹，^12，1....

研究方案

1. 通过盐渍透析组装核小体核心颗粒

注意：使用重组组蛋白进行结构研究的核小体核心颗粒的制备已被其他人详细详细描述¹⁴，^15，16。按照其他人^14，15描述的重组X. laevis组蛋白和组蛋白八聚体组装的纯化，并如下所述组装核小体底物。

1. 以指示的规模购买三种寡核苷酸（如 表1所列）：UND-197mer，161mer，35mer。
   1. PAGE纯化超聚体（197mer和161mer），如^所述17。
      1. 在1x退火缓冲液（10mM Tris-Cl，pH 8.0，50mM NaCl）中等摩尔量的寡核苷酸退火。例如，混合 40 μL 161-mer [166.7 μM];8 μL 35-mer [292.4 μM];16.8 μL 197-mer 复合链 [408.2 μM];10 μL 10x 退火缓冲液和 10.9 μL dH₂O。
         注意：用温度梯度控制退火反应至关重要。有关温....

结果

正确组装的NCP（图2）用于与MBP-Polβ-APE1的重组融合蛋白制备复合物（图3）。为了确定NCP与MBP-Polβ-APE1形成稳定复合物的比例，我们进行了电泳迁移率位移测定（EMSA）（图4），该测定显示NCP的单移带与5倍摩尔过量的MBP-Polβ-APE1。在优化制造这种复合物的过程中，与戊二醛交联对于防止NCP分崩离析至关重要。最初，NCP-Polβ-APE1复合物.......

讨论

纯化DNA修复因子的特定方案将取决于感兴趣的酶。然而，有一些一般性建议，包括使用重组方法进行蛋白表达和纯化¹⁸;如果感兴趣的蛋白质太小（<50 kDa），则通过冷冻电镜进行结构测定几乎是不可能的，直到最近通过使用融合系统¹⁹，纳米抗体结合支架²⁰和优化成像策略²¹。

在初始阶段获得劣质网格是很?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES; pH 7.5	Thermo Fisher Scientific	15630080
1 M MgCl2	Thermo Fisher Scientific	AM9530G
10x TBE	Bio-rad	1610733
25% glutaraldehyde	Fisher Scientific	50-262-23
3 M KCl	Thermo Fisher Scientific	043398.K2
491 prep cell	Bio-rad	1702926
Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)	Millipore Sigma	Z717185
Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)	Millipore Sigma	UFC8030
AutoGrid Tweezers	Ted Pella	47000-600
Automatic Plunge Freezer	Leica	Leica EM GP
C-1000 touch thermocycler	Bio-rad	1851148
C-clips and rings	Thermo Fisher	6640--6640
Clipping station	SubAngostrom	SCT08
Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa)	Fisher Scientific	15370752
Diamond Tweezers	Techni-Pro	758TW0010
dsDNA	Integrated DNA techonologies	N/A
FEI Titan Krios	Thermo Fisher	KRIOSG4TEM
FPLC purification system	AKTA Pure	29018224
Fraction collector Model 2110	Bio-rad	7318122
Glow Discharge Cleaning System	Ted Pella	91000S
Grid Boxes	SubAngostrom	PB-E
Grid Storage Accessory Pack	SubAngostrom	GSAX
Liquid Ethane	N/A	N/A
Liquid Nitrogen	N/A	N/A
Minipuls 3 peristaltic two-head pump	Gilson	F155008
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels	Thermo Fisher Scientific	EC6695BOX
Pipetman	Gilson	FA10002M
Pipette tips (VWR) Low Retention	VWR	76322-528
Polyacrylamide gel solution (37.5:1)	Bio-rad	1610158
polyethylene glycol (PEG)	Millipore Sigma	P4338-500G
Pur-A-lyzer Maxi 3500	Millipore Sigma	PURX35050
Purified recombinant DNA repair factor	N/A	N/A
R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids	Quantifoil	N1-C14nCu30-01
Recombinant histone octamer	N/A	N/A
Spring clipping tools	SubAngostrom	CSA-01
Superdex 200 column 10/300	Millipore Sigma	GE28-9909-44
Transmission Electron Microscope	Thermo Fisher	Talos Arctica 200 kV
Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I	Ted Pella	47000-500
UltraPure Glycerol	Thermo Fisher Scientific	15514011
Vitrobot	Thermo Fisher	Mark IV System
Whatman Filter paper (55 mM)	Cytiva	1005-055
Xylene cyanol	Thermo Fisher Scientific	440700500
Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL	Thermo Fisher Scientific	89877