巴西黑线虫感染模型中产生IL-9的淋巴细胞研究策略

摘要

表达IL-9的T和ILC2细胞在 巴西猪笼草 感染期间被诱导，但由于它们的低频率和差异动力学，它们的表征在感染的肠道中在很大程度上被忽视了。该协议描述了从不同靶器官中分离这些细胞，并通过不同感染阶段的流式细胞术 确认 其身份。

摘要

IL-9是一种多效性细胞因子，与各种过程相关，包括抗肿瘤免疫，过敏病理诱导和对蠕虫感染的免疫反应，其中它在寄生虫的排出中起重要作用。在 巴西黑圆线虫 感染的小鼠模型中，IL-9主要由肺、小肠和引流淋巴结中发现的CD4 + T淋巴细胞和先天淋巴细胞产生。鉴于IL-9细胞内染色所涉及的技术困难，以及在感染时从小肠分离造血细胞的复杂性，迫切需要一个全面但直接的方案来分析IL-9在该模型中不同淋巴和非淋巴组织中的表达。此处描述的方案概述了CD4 + T细胞和先天淋巴样细胞在整个感染过程中在肺和小肠（ 巴西奈瑟菌靶向的主要器官）以及纵隔和肠系膜淋巴结中产生的IL-9的动力学。此外，它还详细说明了感染所需的幼虫数量，具体取决于感兴趣的细胞类型和器官。该协议旨在通过提供专注于 巴西猪笼草 感染模型中感兴趣的特定细胞、器官和疾病阶段的机会，协助测定的标准化以节省时间和资源。

引言

钩虫是肠道寄生虫，感染全世界约7亿人，主要在不发达国家的热带地区。 十二指肠钩瘤 和美洲钩虫（人类最常见的 钩虫寄生虫）的高强度感染会导致贫血和蛋白质缺乏，从而导致生长和智力发育延迟¹。 美洲猪笼草 和啮齿动物寄生虫巴西 圆线虫 在其宿主中诱导原型2型免疫反应，并且在其生命周期中具有相似性。因此， 巴西猪笼草 小鼠感染是人类钩虫感染最常用的模型。3期（L3） 巴西猪笼草 感染性幼虫在感染后的最初几个小时内从皮肤移动到肺部。一旦进入肺部，它们就会变成L4并沿着气管向上迁移，被吞咽，通过胃，并在4-5天内到达肠道成为成虫（L5）。在肠道中，L5蠕虫产卵，这些卵在粪便中排泄以重新启动寄生虫生命周期²。

巴西猪笼草诱导的免疫应答的特征是几种 2 型细胞因子增加，包括 IL-4、IL-5、IL-9、IL-10 和 IL-13，以及嗜酸性粒细胞增多、嗜碱性粒细胞增多、杯状细胞和肥大细胞增生，以及 IgG1 和 IgE 生成增加。大多数试图识别和定义巴西奈瑟菌感染时引发的免疫反应的研究都集中在IL-4或IL-13在该模型³中的作用上。然而，表达IL-9的细胞的鉴定和表征以及这种细胞因子的功能在很大程度上被忽视了，直到Licona-Limón等人发表了第一项研究，证明IL-9在针对巴西猪笼草的免疫反应中的关键作用。本研究使用报告小鼠将T细胞（主要是辅助性T细胞9）和2型先天淋巴细胞（ILC2）描述^为感染时表达IL-9的主要细胞亚群4。

从蠕虫感染的肺部分离和表征免疫细胞是可行的，并且已被广泛报道^3，4。然而，由于固有的组织重塑和粘液的产生，在受感染的肠道中这样做被证明是一个技术挑战，直到最近Ferrer-Font等人5的^发表。该小组概述了一种方案，用于分离和分析来自 Heligmosomoides polygyrus感染的鼠肠的免疫亚群的单细胞悬浮液。基于此，我们现在已经标准化了从 巴西猪笼草 感染肠道中分离和细胞术分析表达IL-9的淋巴细胞的方案。此外，我们已经建立了来自整个感染过程中不同细胞来源和解剖位置的IL-9动力学。

表征参与这种感染的不同细胞群对于更广泛地了解对寄生虫的免疫反应及其与宿主的相互作用至关重要。这个全面的方案提供了一条明确的途径，可以在感兴趣的疾病阶段从所需器官中分离和分析产生IL-9的细胞，从而可以显着提高有关这些细胞在 巴西猪笼草 感染和寄生虫感染中的作用的知识。

研究方案

这里描述的所有动物实验都得到了墨西哥国立自治大学细胞生理学研究所动物处理内部委员会（CICUAL）的批准。

注意:整个协议的流程图如图 1 所示。

1. 老鼠的住房

1. 使用8-10周龄的雌性或雄性小鼠组，在12小时光照/黑暗循环中饲养在具有恒定温度和湿度的动物设施中， 随意获取水和 食物。
   注意:该协议在C57BL / 6背景中使用IL-9报告小鼠品系，如^前所述4;然而，可以使用其他IL-9报告菌株⁶，⁷，^8，以及细胞内IL-9染色^{，结果各不相同}9。

2.小鼠感染

1. 在感染前1天将小鼠的背部从身体中间剃到尾巴底部附近。麻醉剂的使用不是必需的。
2. 如^前所述2，11^，在下背部的100μL磷酸盐缓冲盐水（PBS）¹⁰中皮下接种每只小鼠200个活的第三阶段巴西猪笼草幼虫（L3），或单独注射100μLPBS作为对照。在感染后第 4 天、第 7 天或第 10 天处死动物。

3.肺、小肠、纵隔、肠系膜淋巴结分离

1. 通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死。将鼠标放在背上，喷洒70%乙醇。用剪刀做一个中线切口，打开皮肤，露出腹部和胸部区域。
   注意:异氟醚可用作替代安乐死方法¹²。不建议使用二氧化碳室，因为 CO₂ 会导致肺组织损伤和出血¹³。
2. 分离纵隔淋巴结和肺
   1. 在胸骨处切开一个切口，切成"V"形，以去除肋骨和胸肌。一旦胸腔暴露，将纵隔淋巴结定位在食道旁边，心脏下方（见 补充图1）。
   2. 提取纵隔淋巴结并将其收集在12孔培养板中的1mL R-10培养基（表1）中。在冰上保存，避光直至加工。
      注意:样品应避光，以避免减少这些实验中使用的报告小鼠的荧光信号。
   3. 提取肺并将其收集在每只小鼠12孔培养板中的1mL R-10培养基中。在冰上保存，避光直至加工。
3. 分离肠系膜淋巴结链和小肠
   1. 暴露腹膜腔，并小心地将小肠向右移动，以暴露沿结肠的肠系膜淋巴结（MLN）链。
   2. 用镊子取出MLN，在纸巾上轻轻滚动，然后拉下脂肪。
   3. 将 MLN 转移到 12 孔培养板中的 1 mL R-10 培养基中。在冰上保存，避光直至加工。
   4. 切开幽门括约肌下方和盲肠上方的小肠。在镊子的帮助下慢慢拉出肠道，去除附着的肠系膜和脂肪组织。
   5. 将小肠放在纸巾上，并用PBS大量润湿。用剪刀从小肠上取下佩耶氏贴片。
      注意:为了保持活力，请去除剩余的脂肪组织，并在整个过程中用PBS保持小肠湿润。
   6. 用剪刀纵向切开小肠，将镊子轻轻滑过开放的肠，去除粪便和粘液。
   7. 用镊子握住小肠，小心地将其浸入冰上的 5 mL PBS 中洗涤几次。重复两次。
   8. 将小肠切成短块（约5毫米），并将它们收集在50 mL锥形管中，其中含有10 mL HBSS¹⁴ 和2%FBS（表1）。立即继续分离上皮内和固有层细胞。

4.制备小肠、肺和淋巴结的单细胞悬液

注意:从小肠制备单细胞悬浮液时，每人最多处理六只小鼠非常重要，因为细胞活力随着处理时间的延长而显着降低。该方法改编自 Heligmosomoides polygyrus 感染小鼠模型⁵。

1. 在37°C下预热振荡培养箱，R-20培养基，HBSS和HBSS-2mM EDTA（表1）。
2. 每个样品制备10 mL小肠消化培养基（表1）。
3. 用手用力摇晃步骤3.3.8中的肠片。
4. 通过玻璃漏斗上的尼龙网（约10 cm x 10 cm）过滤每个样品。通过在网眼上加入 10 mL 预热的 HBSS 来洗涤样品并丢弃流通物。再重复一次。
   注意:为每个样品使用一个新的网格，并在整个过程中重复使用它。
5. 从漏斗中取出网布，并将网孔中的样品收集在装有10 mL温热HBSS-2 mM EDTA的50 mL锥形管中（步骤4.1）。在37°C孵育10分钟，以200rpm振荡。
6. 以最大速度 （3，200 rpm） 涡旋 10 秒，并在玻璃漏斗上用网状物过滤样品，回收 50 mL 锥形管中的流出物。
7. 重复步骤 4.5 和 4.6 两次，在同一 50 mL 锥形管中回收流出物。上皮内细胞位于这个 30 mL 级分中。保存剩余的组织。
8. 上皮内细胞的单细胞悬液制备
   1. 在室温（RT）下以450× g 离心在步骤4.7中回收的30mL细胞悬液5分钟。弃去上清液。
   2. 加入 5 mL PBS 并在室温下以 450 x g 离心 5 分钟。 弃去上清液。
   3. 将细胞沉淀重悬于3 mL RPMI 10%FBS-20 μg/mL DNase中（表1）。保持在冰上，避光直到细胞染色。
9. 由固有细胞层制备单细胞悬液
   1. 通过将超过 10 mL 的温热 HBSS 倒入漏斗上的网状物来洗涤步骤 4.7 中剩余的小肠组织。重复洗涤。将网状物中的组织收集在装有 10 mL 小肠消化培养基的 50 mL 锥形管中。
   2. 在37°C孵育30分钟，以200rpm振荡。每5分钟以最大速度涡旋10秒。
   3. 加入 10 mL FACS-EDTA 缓冲液（表 1）以停止消化反应，并将其置于冰上。
   4. 使用血清移液管通过 100 μm 细胞过滤器过滤每个样品，在放置在冰上的 50 mL 锥形管中回收悬浮液。
   5. 在4°C下以600× g 离心6分钟。
   6. 弃去上清液。用5mL PBS洗涤细胞沉淀，并在4°C下以600× g 离心6分钟。
   7. 弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 1 mL RPMI 10% FBS-20 μg/mL 脱氧核糖核酸酶中。保持在冰上，避光直到细胞染色。
10. 肺单细胞悬液制备
    注意:每个肺和小肠应由两个人并行处理，以避免延长处理时间，从而导致细胞活力低下。
    1. 每个处理的样品准备 4 mL 肺消化培养基（表 1）。
    2. 从步骤3.2.3中从含有肺的孔中取出RPMI培养基。用细剪刀将肺切成小块。
    3. 用刮刀将肺碎片转移到 15 mL 锥形管中。加入4 mL肺消化培养基（表1）。
    4. 在37°C下孵育30分钟，以250rpm振荡。完成后，继续在冰上，直到每个样品都得到处理。
    5. 通过放置在6孔培养板的单孔中的100μm细胞过滤器过滤每个样品。用注射器柱塞解离组织。
    6. 在 15 mL 锥形管中回收每个样品，并加入 4 mL R-2 培养基（表 1）。在处理其他样品时保持冰上。
    7. 在4°C下以600× g 离心5分钟。 弃去上清液并将细胞沉淀重悬于1mL R-5培养基中（表1）。
    8. 离心时，每个样品制备4 mL的27.5%密度梯度溶液（表1），以富集造血细胞级分^15，16。与其他类似的密度梯度培养基相比，这种单细胞分离策略更有效、更具成本效益且毒性更小¹⁷.
    9. 将4mL的27.5%密度梯度溶液加入步骤4.10.7的1mL细胞悬液中，并剧烈摇晃。
    10. 在混合悬浮液上缓慢加入 1 mL R-5 培养基（表 1）以形成两相。
    11. 在室温下以 1，500 x g 离心 20 分钟，低加速度和制动器关闭。观察两相之间形成的环。
    12. 用 1 mL 微量移液器回收两相之间形成的环，并重悬于 4 mL R-2 培养基中。
    13. 在4°C下以450× g 离心5分钟。 弃去上清液。将细胞沉淀重悬于1mL ACK缓冲液中（表1），并在室温下孵育1分钟。
    14. 加入4mL的R-5培养基，并在4°C下以450× g 离心5分钟。 弃去上清液并将细胞沉淀重悬于1mL R-10培养基中。保存在冰上，避光直至染色以进行流式细胞术。
11. 淋巴结单细胞悬液制备
    1. 将步骤3.2.2或3.3.3中的淋巴结放在6孔培养板中的两片网片之间，并用注射器柱塞解离。
    2. 在1.5mL锥形管中回收细胞悬液，并在4°C下以450× g 离心5分钟。
    3. 弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于1mL R-10培养基中。保存在冰上，避光直至染色以进行流式细胞术。
       注意:如果可见团块，请通过100μm细胞过滤器过滤样品。

5.流式细胞术的细胞染色（图2和图3）

注意:将步骤4.11.3中的淋巴结细胞悬液在450× g 下在4°C下离心5分钟，并将细胞沉淀重悬于500μLFACS缓冲液中（表1）。

1. 用于鉴定ILC2的细胞染色（图3 和 补充图2）
   注意:此染色程序特定于鉴定表达IL-9的ILC2细胞。
   1. 在96孔锥形底部培养板中，从步骤4.10.14中板每个肺样品（约1.8 x 10 6个细胞）板150μL，从步骤4.11.3中板每个淋巴结样品50μL（纵隔和肠系膜淋巴结样品分别约为0.7 x 10 6和2.2 x 10⁶细胞）。加入 100 μL FACS 缓冲液，并在 4 °C 下以 450 x g 离心 5 分钟。
   2. 在96孔锥形底部培养板中，来自步骤4.8.3和4.9.7的每个小肠样品板100μL（上皮内和固有层样品分别约为2.7 x 10^6和 0.6 x 10⁶ 细胞）。加入 150 μL FACS 缓冲液，并在 4 °C 下以 450 x g 离心 5 分钟。
   3. 弃去上清液，并将每个细胞沉淀重悬于在FACS缓冲液中稀释的50μL生物素化抗体混合物（表2）中。在4°C避光孵育30分钟。
      注意:使用含有20μg/ mL DNase的FACS缓冲液用于上皮内和固有层样品。
   4. 加入 150 μL FACS 缓冲液。在4°C下以450× g 离心5分钟。
   5. 弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 200 μL FACS 缓冲液中。再次离心并弃去上清液。
   6. 将细胞沉淀重悬于50μL抗体/染色混合物中（表2），并在4°C避光下孵育30分钟。
   7. 加入 150 μL FACS 缓冲液。在4°C下以450× g 离心5分钟。
   8. 弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 200 μL FACS 缓冲液中。再次离心并弃去上清液。重复洗涤（步骤5.1.7），弃去上清液。
   9. 将细胞沉淀重悬于 300 μL FACS 缓冲液中，并通过流式细胞术进行分析。
   10. 对于小肠和肺样本，使用门控策略:淋巴细胞，单细胞，活细胞，造血细胞，CD90 +谱系细胞，ST2 +细胞和IL-9 +细胞（图3A，B 和 补充图2A）。对于淋巴结样本，使用门控策略:活细胞，单细胞，CD90 +谱系细胞，ST2 +细胞和IL-9 +细胞（补充图2B，C）。
2. 用于鉴定产生IL-9的淋巴细胞的细胞染色（图2 和 补充图3）
   1. 将步骤 4.10.14 的每个肺样品转移 800 μL 到 1.5 mL 管（约 14.6 x 10⁶ 个细胞）中。在4°C下以450× g 离心5分钟。 弃去上清液。
   2. 对于淋巴结样品，将步骤 4.11.3 中的 400 μL 细胞悬液（纵隔和肠系膜淋巴结样品分别为约 5.6 x 10 6 和 17.5 x 10⁶ 细胞）接种在 96 孔锥形底板中，分两步进行。
      1. 首先转移200μL，在4°C下以450× g 离心5分钟，弃去上清液。
      2. 将另外 200 μL 转移到相应的孔中。在4°C下以450× g 离心5分钟，弃去上清液。
   3. 将细胞沉淀重悬于50-400μL抗体/染色混合物中（表3），并在4°C避光下孵育30分钟。
      注意:肺样本应重悬于400μL中，纵隔淋巴结样本重悬于50μL中，肠系膜淋巴结样本重悬于100μL染色混合物中。
   4. 向纵隔淋巴结样品中加入 150 μL FACS 缓冲液，向肠系膜淋巴结样品中加入 100 μL 的 FACS 缓冲液。在4°C下以450× g 离心5分钟，弃去上清液。
   5. 通过将沉淀分别重悬于 1 mL 和 200 μL FACS 缓冲液中来洗涤肺和淋巴结样品。在4°C下以450×g 离心5分钟。 弃去上清液并重复洗涤。
   6. 将肺样品重悬于 600 μL FACS 缓冲液中，并通过流式细胞术进行分析。使用门控策略:淋巴细胞，单细胞，活细胞，造血细胞，CD4 + TCRβ +细胞和IL-9 +细胞（图2A）。
   7. 将淋巴结样品重悬于 300 μL FACS 缓冲液中，并通过流式细胞术进行分析。使用门控策略:淋巴细胞，单细胞，活细胞，CD4 + TCRβ +细胞和IL-9 +细胞（图2B 和 补充图3A）。

6. 单细胞悬浮液中细胞绝对数量的测定

1. 用 PBS 以 1:20 的比例（10 μL 样品 + 190 μL PBS）稀释分离步骤 4.8.3、4.9.7、4.10.14 和 4.11.3 中的样品。
2. 将步骤 6.1 中的每个稀释样品 10 μL 与 10 μL 台盼蓝混合。将 10 μL 加载到血细胞计数器中并计数活细胞，考虑每次稀释。
3. 通过将流式细胞术确定的活细胞（活力染料阴性细胞）中感兴趣的群体百分比乘以分离后单细胞悬液中的活细胞总数，然后将该数字除以100（补充图4，补充图5和补充图6），获得细胞的绝对数。
   绝对数=（通过流式细胞术测定的活细胞目标群体的百分比x单细胞悬液中的活细胞总数）/100

结果

小鼠皮下注射200 L3期 巴西猪笼草 幼虫，或用PBS进行假对照。调整了该协议中使用的幼虫数量，以便从肺，淋巴组织和小肠中分离出活细胞，这与以前的报告不同，以前的报告使用更高的蠕虫负荷来检测淋巴组织和肺部中的细胞仅⁴。在感染后第 0、4、7 和 10 天采集肺、纵隔淋巴结、肠系膜淋巴结和小肠，用于淋巴细胞分离和 IL-9 生成人群的特征。在两个或多个独立实验中?...

讨论

要全面了解肠道寄生虫-宿主相互作用和对蠕虫感染的免疫反应，需要鉴定和分析不同的细胞群和效应分子，这些细胞群和效应分子是诱导组织重塑和蠕虫排出的关键。土壤传播的蠕虫感染是全世界发展中国家的一个大问题。然而，直到最近，还没有允许分析受这种感染影响的主要器官小肠中存在的稀有细胞群^{的方案5。}该协议涵盖了先前描述的方法，这些方法允许在 巴西奈瑟...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACK buffer	Homemade
Attune Nxt cytometer	Thermofisher
B220	Biolegend	103204
CD11b	Biolegend	101204
CD11c	Biolegend	117304
CD19	Biolegend	115504
CD4	Biolegend	100404
CD4 (BV421)	Biolegend	100443
CD45.2	Biolegend	109846
CD8	Biolegend	100703
CD90.2	Biolegend	105314
Collagenase D	Roche	11088866001
DNAse I	Invitrogen	18068015	Specific activity: ≥10 000 units/mg
Facs ARIA II sorter	BD Biosciences
FACS Melody cell sorter	BD Biosciences
Fc-Block	Biolegend	101320
FcεRI	eBioscience	13589885
Fetal bovine serum	Gibco	26140079
FlowJo	FlowJo		Flow cytometry analysis data software
Gr-1	Tonbo	305931
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Homemade
IL-9	biolegend	514103
NK1.1	Biolegend	108704
Nylon mesh	‎ lba	B07HYHHX5V
OptiPrep Density Gradient Medium	Sigma	D1556
Phosphate-buffered saline	Homemade
RPMI	Gibco	11875093
Siglec F	Biolegend	155512
Streptavidin	Biolegend	405206
TCR-β	Biolegend	109203
TCR-β (PE/Cy7)	Biolegend	109222
TCR-γδ	Biolegend	118103
Ter119	Biolegend	116204
Tricine buffer	Homemade
Zombie Aqua Fixable Viability Dye	Biolegend	423101