剥离印迹技术:一种冷冻电镜样品制备方法，用于从多层或浓缩生物样品中分离单层

摘要

剥离-印迹技术是一种冷冻电镜网格制备方法，可将多层和浓缩的生物样品分离成单层，以减小厚度、提高样品浓度并促进图像处理。

摘要

剥离印迹冷冻电镜网格制备技术是一种经过显著修改的背进样方法，目的是减少多层样品的层数。在冷冻之前去除层有助于将样品厚度降低到适合冷冻电镜数据收集的水平，提高样品平坦度并促进图像处理。剥离-印迹技术允许将多层膜分离成单层，将分层的2D晶体分离成单个晶体，并将可溶性蛋白质的堆叠片状结构分离成单层。这些类型样品的高样品厚度经常给冷冻电镜数据收集和冷冻电镜图像处理带来无法克服的问题，特别是当显微镜载物台必须倾斜以进行数据收集时。此外，可以制备高浓度的这些样品的网格以进行有效的数据收集，因为可以增加网格制备之前的样品浓度，并且可以调整剥离印迹技术以产生单层样品的密集分布。

引言

开发剥离印迹技术是为了将堆叠的膜蛋白二维晶体分离成单层，以获得用于冷冻电镜 2D 和 3D 数据收集的适当薄样品，并促进图像处理¹.该方案同样适用于其他类型的多层样品，以及在不增加Z厚度的情况下在网格上实现任一样品类型的高样品浓度。

通过在协议中施加毛细管压力和剪切力的组合，将样品层减少到一层，该方案大大扩展并修改了背注方法²。第一个印迹步骤导致紧密夹层，并在亚微米（而不是背面进样方法中的20-25μm滤纸孔径）上粘附在多层样品两侧的碳膜和网格条上。一旦将网格垂直压在海藻糖液滴上，迫使碳膜远离网格条，就会发生单个层的分离或剥离，从而迫使夹层分离（图 1）。在下一步中，当网格再次印迹在亚微米滤纸上时，碳膜将远离与网格条的原始接触点重新定位。这些步骤的迭代次数可以针对特定样本进行优化。此外，该方案可用于增加样品浓度，同时避免聚集在Z中。 由于依赖于对网格条和碳膜的粘附以及强制分离，这种方法可能不适用于高度脆弱的分子，例如某些脆弱和/或不稳定的蛋白质和蛋白质复合物。

剥离印迹技术既不需要专门的设备，也不需要昂贵的耗材。然而，对特定样品的适用性需要仔细考虑生物参数。对于2D晶体来说，这个决定更容易，因为需要碳膜来确保平整度，但通过剥离印迹技术 进行操作 可能会影响样品或晶体顺序的生物完整性。剥离印迹技术对单个颗粒的适用性仅限于需要碳膜且对操作稳定的颗粒，并且可以对其进行测试。层间具有关键生物相互作用的标本可能不适合借助剥离-印迹技术进行表征，因为这种相互作用会中断。

剥离-印迹技术（"剥离-印迹"）通过在室温下通过 TEM 对阴性染色或未染色样品进行测试和筛选来最快速地优化。一旦确定了最佳的剥离-印迹迭代次数，就可以确定玻璃化前控制厚度的时间。

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研究方案

1. 剥离印迹技术的制备步骤

注意:准备工作需要将以下物品彼此相邻放置。

1. 堆叠两张20-25μm孔径的滤纸（见 材料表）。
2. 将~8 cm x 10 cm长的石蜡薄膜放在滤纸旁边，纸张朝上。
3. 将一张亚微米滤纸放在另外两张#4滤纸的顶部（图1-1）。
4. 将反毛细管镊子放在弯曲的腿朝上，直腿朝下。然后，选择一个 600 目网格，光滑/有光泽的一面朝上。将镊子放在培养皿或其他凸起的表面上，以避免干净的网格与其他物品接触。
5. 从石蜡膜上取下纸张，拉动侧面（~5 毫米）以形成一个小边缘。从石蜡膜的一个短边移取两滴 150 μL 的 4% 海藻糖溶液 ~1-2 cm，在石蜡膜上相距 ~1 cm。
6. 在单独的工作台上或地板上，将液氮倒入小型聚苯乙烯泡沫容器中（见 材料表）。
   注意:接受使用手套和面罩正确操作的培训，以避免冻伤。
7. 将一个小的冷冻电镜网格容器放入液氮中，并用无绒湿巾覆盖聚苯乙烯泡沫容器。

2. 将碳膜放置在网格上

1. 使用Dumont #5镊子（见 材料表）将碳膜从云母中漂浮，方法是在其中一滴海藻糖溶液上以轻微的角度向下（~20°-40°）接触云母的一侧，并通过向下移动云母来缓慢地让水张力从碳膜上抬起。一旦碳膜漂浮在液滴表面，就释放云母。
2. 目视检查碳膜，以避免使用以裂缝形式损坏的碳。
3. 将反毛细管镊子以一定角度（~20°-30°）固定的网格插入与碳膜相邻的位置的海藻糖滴中，然后在碳膜下居中。拿起碳膜（图1-2）。
4. 保持网格处于相同的方向，并缓慢地将其降低到第二滴海藻糖的表面上，而不会破坏滴的表面张力，以去除可能缠绕在网格边缘到粗糙面的不必要的碳膜。

3. 将多层二维晶体分离成单层

1. 旋转反毛细管镊子（见 材料表）并将它们放在培养皿上，网格的碳面朝下（图1-3）。
2. 将 1.3 μL 样品移液到网格顶部的轻微海藻糖弯月面中。将溶液移液~8-10次，以混合并将海藻糖和样品分布在网格的两侧。
3. 在孵育溶液 1 分钟时，将一滴或多滴 1.7 μL 海藻糖溶液移液到石蜡膜上。
4. 将网格旋转回其原始位置，碳膜朝上。
5. 使用反毛细管镊子将网格压在亚微米滤纸上（图1-4）。一旦溶液被滤纸吸收并且碳膜平放，等待 3 秒，然后提起网格并将其垂直移动到 1.7 μL 海藻糖溶液滴上（图 1-5）。
   注意:对高度堆叠的样品多次重复此步骤，或者在后续步骤中准备网格进行玻璃化。
6. 在两张滤纸上吸干网格，然后从滤纸上提起网格（图1-6）。大约 13 秒后，根据湿度和样品缓冲液，将网格放入小型聚苯乙烯泡沫塑料容器中的液氮中，然后将网格放入冷冻电镜网格容器中或直接转移以进行冷冻电镜筛选或数据收集。
   注意:为了快速优化方案，请在此步骤中对剥离印迹网格进行负染色，而不是将其投入液氮中。通过将 3 μL 1% 乙酸铀酰施加到网格上对样品进行负染色，将网格孵育 30 秒，并用撕裂的 20-25 μm 孔径滤纸吸干。在海藻糖、单宁或葡萄糖中玻璃化的 2D 晶体网格通常用手浸入玻璃化，因为海藻糖、单宁和葡萄糖可防止以用于手动浸入的速率形成结晶冰²。

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结果

成功的剥离印迹实验将产生通常高浓度的单层样品。预计大多数网格方块中的某些区域仍将包含多个层，尤其是在剥离印迹步骤迭代次数较少的情况下。然而，大多数网格正方形将包含广泛的单层区域，如人白三烯C₄合酶（图2）和脂质体（在步骤3.2， 图3中添加）的2D晶体所观察到的那样。可能需要对未显示所需层数减少的样品测试额外的剥离?...

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讨论

剥离印迹是一种强大的方法，可以克服多层二维晶体和类似样品的堆叠和厚度，以进行冷冻电镜数据收集和图像处理。关于使用剥离印迹的决定将基于样品的生物学参数，一旦3D冷冻电镜模型可用，也需要进行评估。接触的生物学重要性和接触区域的潜在灵活性在这项评估中尤为重要。

剥离印迹的数量最初将在标准阴性染色网格制备后通过观察 确定 ，其中过多的层或?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
600-mesh grids	SPI	2060-C-XA
Anti-capillary forceps	Ted Pella	510-5
Carbon to coat mica
Cryo-EM			Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV.  High-resolution data is collected at 300 kV.
Dumpont #5 forceps	Ted Pella	5622
Grid box for cryo-EM storage	Ted Pella	160-40
Kim Wipes
Liquid nitrogen
Mica	Ted Pella	56	The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid.  The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots.
Negative stain			1-2% uranyl acetate is suitable for many samples.  Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted.
Parafilm
Polystyrene container			Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil.
Submicron filter paper	MilliporeSigma	DAWP04700
Transmission electron microscope	JEOL	JEM-1400	Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids.
Trehalose			Prepare 4% trehalose solution.
Whatman #4 filter paper	MilliporeSigma	WHA1004150	This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol.