从人血浆中富集星形胶质细胞衍生的细胞外囊泡

摘要

该方案描述了从人血浆中富集星形胶质细胞衍生的细胞外囊泡 （ADEV）。它基于通过聚合物沉淀分离 EV，然后基于 ACSA-1 的 ADEV 免疫捕获。ADEV 的分析可能为通过液体活检非侵入性地研究活体患者炎症通路的变化提供线索。

摘要

细胞外囊泡 （EV） 是所有细胞分泌的生物纳米颗粒，用于细胞通讯和废物消除。它们通过在生理和病理条件下作用于其他细胞并将其货物转移到其他细胞来参与广泛的功能。鉴于它们存在于生物流体中，EV 是研究疾病过程的极好资源，可以被视为用于发现生物标志物的液体活检。EV 分析的一个吸引人的方面是，可以根据其来源细胞的标记物来选择它们，从而反映其货物中特定组织的环境。然而，与 EV 分离方法相关的主要障碍之一是缺乏方法共识和标准化方案。星形胶质细胞是在大脑中起重要作用的神经胶质细胞。在神经退行性疾病中，星形胶质细胞反应性可能导致 EV 货物改变和异常的细胞通讯，从而促进/增强疾病进展。因此，星形胶质细胞 EV 的分析可能会导致发现生物标志物和潜在的疾病靶标。该方案描述了从人血浆中富集星形胶质细胞衍生的 EV （ADEV） 的 2 步方法。首先， 通过 基于聚合物的沉淀从去纤维化血浆中富集 EV。然后通过基于 ACSA-1 的磁性微珠免疫捕获富集 ADEV，其中重悬的 EV 被加载到放置在磁场中的色谱柱上。磁性标记的 ACSA-1+ EV 保留在色谱柱内，而其他 EV 则流过。从磁体中取出色谱柱后，ADEV 被洗脱并准备好用于储存和分析。为了验证星形胶质细胞标志物的富集，可以在洗脱液中测量神经胶质纤维酸性蛋白 （GFAP） 或其他细胞内来源的特异性星形胶质细胞标志物，并与流出液进行比较。该协议提出了一种简单、省时的方法，从血浆中富集 ADEV，可用作检查星形胶质细胞相关标志物的平台。

引言

细胞外囊泡 （EV） 是由所有类型的细胞分泌的一组异质膜纳米颗粒，携带蛋白质、脂质和核酸¹。微泡 （100-1000 nm）、外泌体 （30-100 nm） 和凋亡小体 （1000-5000 nm） 构成了主要的 EV 类型，其起源位点可区分 ^2,3。EV 调节重要的生理过程，例如抗原呈递和免疫应答⁴、受体回收、代谢物消除⁵ 和细胞通讯⁶。这些过程的调节可以通过 EV 细胞膜中富集的蛋白质与受体细胞中的靶标之间的直接结合，和/或通过它们在受体细胞的细胞质中的内化和释放其货物来实现⁷。虽然 EV 执行基本的细胞功能，但从病理学的角度来看，它们在癌症和神经病学领域引起了越来越多的兴趣。事实上，几项研究表明，EV 可以帮助促进肿瘤细胞迁移 ^8,9 或在神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）中播种有毒蛋白质聚集体^10,11。

可以根据与其来源细胞相关的细胞表面标志物从生物流体中选择和富集 EV，从而反映其货物中特定组织的环境 12,13,14,15,16,17,18,19,20.此外，鉴于它们存在于血液、脑脊液 （CSF）、唾液、尿液和母乳中，EV 是一种极好的非侵入性诊断工具，可以被认为是用于发现生物标志物的液体活检。这在神经学中特别有趣，因为很难研究 CSF 以外的可接触液体中的脑分析物。

星形胶质细胞越来越受到关注，因为它们处于神经血管通讯的交叉点²¹。在生理条件下，它们负责保存血脑屏障、神经递质的循环、为神经元和其他神经胶质细胞提供营养和生长因子 22,23,24 以及神经免疫防御，因为它们的代谢可塑性从促炎状态到抗炎状态，反之亦然 25,26,27.星形胶质细胞完成其调节功能的一个重要机制是通过 EV 进行通信^28,29。反应性星形胶质细胞增多症是多种神经退行性疾病的关键标志，例如阿尔茨海默病³⁰、多系统萎缩症 （MSA）、进行性核上性麻痹 （PSP）³¹ 和肌萎缩侧索硬化症 （ALS）³²。星形胶质细胞反应性可能导致 EV 货物改变、炎症介质释放和异常的细胞通讯，从而促进病理的传播并导致神经退行性变^10,11。因此，研究星形胶质细胞衍生的 EV （ADEV） 及其货物的变化是一种有吸引力的资源，可以以非侵入性方式检查神经退行性过程。

目前，有几种隔离 EV 的方法，每种方法都有其相应的优点和缺点³³。必须考虑哪种方法更适合特定用途，具体取决于最终感兴趣的应用。在神经学领域，更具体地说，在星形胶质细胞研究中，基于聚合物的沉淀后进行免疫捕获一直是主要使用的方法 ^{12,18,19,20,34}。然而，即使应用相同的方法，应用于 EV 分离的不同步骤中的研究之间仍然存在异质性。因此，需要一种清晰、循序渐进的标准化方法来促进星形胶质细胞 EV 研究和研究可重复性。基于聚合物的沉淀有助于生物标志物筛选，因为它是一种快速、简单的程序，不需要复杂的设备，可在不影响其生物活性的情况下获得高产量的 EV³⁵。

本方案描述了一种详细、简单的两步法，用于从人血浆中富集 ADEV。它基于基于聚合物的 EV 总组分沉淀，然后对星形胶质细胞 EV 进行免疫捕获。鉴于星形胶质细胞的重要功能，对 ADEVs 的分析可能为发现可以以非侵入性方式研究的生物标志物和脑炎症通路提供线索。

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研究方案

本协议中描述的研究是使用来自西班牙巴塞罗那³⁶ 的 Sant Pau 神经退行性疾病倡议 （SPIN） 队列的男女健康成年供体（年龄范围 65.9-81.3 岁，45.5% 女性）的人类血浆样本进行的。参与者给予了知情同意。该研究是按照赫尔辛基宣言和西班牙法律中包含的医学研究国际伦理准则进行的。Sant Pau 研究伦理委员会 （CEIC） 审查并批准了从 SPIN 队列中收集和储存人血浆样本的方案 （#16/2013）。

1. 从人血浆中富集星形胶质细胞 EV

注意：该协议涉及使用人血浆样品。有关本协议中使用的试剂和实验室材料的所有详细信息都包含在 材料表中。此程序不需要特殊设备，但是，请查看每个制造商单独指定的每种试剂的安全注意事项。

1. 样本采集和储存
   1. 按照血浆采集的标准化方案，在薰衣草 EDTA 真空采血管中采集血液^36,37。收集后 30-120 分钟内在 4 °C 下以 2000 x g 离心 10 分钟以进行血浆分离。将血浆（显示为上清液的上层透明液体）分 500 μL 等分试样分离。
   2. 要去除细胞碎片，请将等分试样在室温下以 3000 x g 离心 15 分钟。回收上清液。将血浆储存在 -80 °C 直至分析。与生物流体分析的通常做法一样，在储存前将样品分装，并避免超过三个冻融循环。
2. 总 EV 富集
   注：所有使用的试剂必须通过 0.22 μm 过滤器过滤。
   1. 解冻 500 μL 血浆样品。以 1：100 的比例添加凝血酶以去除凝血因子。倒置混合 3 次，并在室温下静置 5 分钟。
   2. 用 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 工作溶液完成体积，达到 1 mL：DPBS + 3x 浓蛋白酶抑制剂混合物（从 10x 蛋白酶抑制剂混合物原液中稀释）。倒置混合。
   3. 将样品在 4 °C 下以 6000 x g 离心 20 分钟。 回收上清液。用 DBPS 工作溶液完成体积，达到 1 mL。
   4. 加入 252 μL EV 沉淀溶液，倒置混合 3 次。在 4 °C 下孵育 60 分钟。
   5. 将样品在 4 °C 下以 1500 x g 离心 20 分钟，以沉淀总 EV 馏分（沉淀）。收集 1 mL 上清液。将级分标记为EV耗尽血浆，用作EV富集标记物（无EV）的阴性对照，并储存在-80°C。
   6. 将剩余的沉淀在 4 °C 下以 1500 x g 离心 5 分钟。 丢弃剩余的上清液。将沉淀重悬于 500 μL 含有浓蛋白酶和磷酸酶抑制剂（终浓度 3 倍，从 100 倍原液中稀释，参见 材料表）的超纯水中。
   7. 用力上下移液以松开沉淀，避免起泡;在室温下在旋转管振荡器上涡旋和搅拌 30 分钟，直至完全重悬。确保沉淀物完全重悬，因为这是后续免疫捕获步骤的关键步骤。
3. ADEV 的免疫捕获
   注意：ADEV 带有星形胶质细胞标志物。通过免疫捕获富集 ADEV 的选定标志物是 GLAST。GLAST 代表谷氨酸-天冬氨酸转运蛋白 （UniProtKB-P43003），是主要由小脑和大脑新皮层中的星形胶质细胞表达的最丰富的谷氨酸转运蛋白³⁸。抗 GLAST （ACSA-1， 星形胶质细胞表面抗原-1） 抗体对 GLAST 的细胞外表位具有特异性，已开发用于鉴定星形胶质细胞。它是从人血浆中免疫捕获 ADEV 的最广泛使用的靶标 12,20,34。
   1. 向含有总 EV 制剂的每个样品中加入 10 μL 抗 GLAST （ACSA-1） 生物素化抗体。轻轻搅拌均匀。在 4 °C 下在旋转管振荡器上孵育 1 小时。
   2. 加入 10 μL 与单克隆抗生物素抗体 （小鼠 IgG1） 偶联的磁性微珠。轻轻搅拌均匀。在 4 °C 下在旋转管振荡器上孵育 1 小时。
   3. 将一根微柱放入 MACS 分离器的磁场中。用 500 μL PBS-0.5% 牛血清白蛋白 （BSA） 冲洗来制备色谱柱。丢弃流出物。
   4. 将 EV/ACSA-1/微珠悬浮液加载到色谱柱上。在此步骤中，请勿用柱塞推动。收集流出。将其标记为非星形胶质细胞 EV（无 ADEV），并在需要时保留为对照。
   5. 用 500 μL PBS-0.5% BSA 洗涤色谱柱两次。丢弃流出物。
   6. 从磁性分离器中取出色谱柱，并将其放入低粘附力的 1.5 mL 收集管中。在色谱柱上移液 500 μL PBS-0.5% BSA。用柱塞用力推入色谱柱并收集洗脱液。
   7. 标记为 ACSA-1+ EV （ADEV）。将未裂解的 EV 短期储存在 -20 °C 下，或在 -80 °C 下长期储存（>6 个月）。
      注意：抗 ACSA-1 抗体将与 GLAST-1/EAAT-1 表位结合。磁性微珠将与抗 ACSA-1-EV 复合物亲和结合。MACS 微型色谱柱包含优化的基质，当放置在磁体中时会产生强磁场，这是保留标记的 ADEV 所必需的。
      有关 ADEV 富集程序的示意图，请参见 图 1。
4. EV 的裂解
   注意：EV 必须完全裂解才能检测囊内标志物。建议使用两种连续方法，例如化学裂解后机械裂解。
   1. 通过添加蛋白质提取试剂（参见 材料表）对 EV 进行化学裂解，每 150 μL 提取试剂添加 100 μL 样品。加入 100 倍蛋白酶和磷酸酶抑制剂以达到 1 倍终浓度。剧烈涡旋，在室温下静置 15 分钟。
   2. 通过两步程序进行机械裂解：将化学裂解的 EV 溶液通过注射器两次（G29 针头）。然后，在超声波冷水浴中对样品进行超声处理 45 秒。将裂解的 EV 在 -80 °C 下冷冻。
   3. 将样品在 37 °C 下解冻 5 分钟。在 -80 °C 下再次冷冻以储存裂解的 EV。分析前在 37 °C 下再次解冻 5 分钟。

图 1：富集星形胶质细胞衍生 EV 的两步程序的示意图。 第一步，通过基于聚合物的沉淀和离心步骤从去纤维化的人血浆中富集 EV。总 EV 重悬后，然后用生物素化抗 GLAST （ACSA-1） 抗体和抗生物素磁性微珠通过免疫捕获来选择星形胶质细胞 EV。缩写：ACSA-1 = 星形胶质细胞表面抗原-1;ADEVs = 星形胶质细胞衍生的细胞外囊泡;DPBS = Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水;EVs = 细胞外囊泡;GLAST = 谷氨酸-天冬氨酸转运蛋白;无 ADEVs = 非星形胶质细胞外囊泡;无 EV = 无细胞外囊泡（EV 耗尽血浆）;PIC = 蛋白酶抑制剂混合物;RT = 室温。使用 BioRender 创建的图。 请单击此处查看此图的较大版本。

2. 协议验证

1. 免疫捕获前总 EV 组分的表征
   1. 使用裂解的总 EV（聚合物沉淀后重悬的沉淀）和稀释的血浆样品进行 Western 印迹分析。用 4x Laemmli 样品缓冲液（15 μL 样品为 5 μL）补充样品，在 90 °C 下煮沸 10 分钟，然后加载到 10% 无染色丙烯酰胺凝胶上。
   2. 在 Tris/甘氨酸/SDS 缓冲液中以 80 V 进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 30 分钟，然后用 200 V 电泳 40 分钟。在 SDS-PAGE 之后，从玻璃板中取出凝胶，并在 UV 激发 1 分钟后观察总蛋白含量。
   3. 通过半干燥系统在 25 V、2.5 A 下将蛋白质从凝胶转移到甲醇活化的 0.2 μm PVDF 膜上，持续 10 分钟（有关设备的详细信息，请参阅 材料表 ）。转移后，在室温下将膜在封闭缓冲液中封闭 5 分钟，然后在 4 °C 下与 Alix （1：1000）、CD9 （1：1000） 或 Calnexin （1：1000） 一抗孵育过夜;有关详细信息 ，请参阅材质表 。
   4. 在含 0.1% Tween 20 （TBST） 的 Tris 缓冲盐水中洗涤膜 3 次，持续 10 分钟，并在室温下与在封闭缓冲液中以 1：7500 稀释的抗兔 HRP 二抗孵育 1 小时。在 TBST 中洗涤膜 4 次，每次 10 分钟。在工作台摇床上轻轻摇动膜，执行所有洗涤和孵育步骤。
   5. 将化学发光溶液与过氧化物缓冲液以 1：1 的比例混合，并在室温下孵育膜 5 分钟。使用化学发光成像系统曝光和采集条带（有关详细信息 ，请参见材料表 ）。
2. 验证 ADEV 组分中星形胶质细胞特异性标志物的富集
   注：神经胶质纤维酸性蛋白 （GFAP） 是星形胶质细胞中的主要中间丝蛋白，也是其细胞骨架发育过程中的必需元素。GFAP 可以在脑组织和生物体液中检测到，是一种众所周知的星形胶质细胞标志物³⁹。因此，使用商业生物标志物检测技术对该标志物进行定量，以证明 ADEV 组分中星形胶质细胞衍生标志物的富集。这种生物标志物技术是一种超灵敏的技术，可以测量单个蛋白质分子，其灵敏度比传统免疫标志物高 1,000 倍。该技术基于使用顺磁性微粒与旨在与特定靶标结合的抗体^40,41（参见材料表）。
   1. 使用裂解的 EV 样品进行生物标志物分析。为了测试星形胶质细胞标志物的富集，使用市售超灵敏免疫测定法比较洗脱液中的 GFAP 水平 （ADEVs） 与流穿液 （No ADEVs）。
   2. 以 1：4 的比例稀释样品（25 μL EV + 75 μL 检测缓冲液），准备校准品，并按照制造商的说明在生物标志物检测设备中进行检测（参见 材料表）。样品可以直接在板上稀释。
   3. 一式两份测试样品和校准品。GFAP 分析的定量范围为 1.37-1000 pg/mL。使用制造商的软件分析平台从校准曲线计算 GFAP 浓度。
   4. 为了估计星形胶质细胞标志物富集方案的变异系数 （CV），测量从合并人血浆样品的相同重复中获得的 ADEV 制剂中的 GFAP 水平，并将 CV 计算为标准差/平均值 x 100。在该方案中，使用 N = 10 个相同的血浆样品计算 CV。
3. 验证 ADEV 组分中 EV 标志物的富集
   1. 为了验证 EV 标志物的富集，请按照制造商的建议，通过 ELISA 测量裂解的未稀释 EV 样品中的 Alix 和 CD81 水平（参见 材料表）。测试样品和校准品一式两份。
   2. 使用酶标仪在 450 nm 和 570 nm 处读取板。使用线性校准曲线计算 Alix 和 CD81 浓度。Alix 分析的定量范围为 47-3000 pg/mL，CD81 的定量范围为 0.156-10 ng/mL。
4. ADEV 的大小和形态特征
   1. 纳米粒子跟踪分析
      1. 使用纳米颗粒跟踪分析 （NTA） 测量新鲜未裂解 EV 制剂的颗粒浓度和粒径分布。
      2. 根据仪器的检测范围（20-100 个颗粒/帧），用过滤的 PBS 稀释新鲜的、未裂解的 ADEV 悬浮液 （10 μL），使用随附的软件录制三个 60 秒视频，设置如下：注射器流速为 30 A.u.，相机水平为 13，检测阈值为 5。校正输入样品体积的颗粒浓度、EV 重悬体积和 NTA 读数所需的稀释度。
         注：建议对包含 EV 车辆溶液的样品进行预可视化，以验证基质效应和重悬 EV 的培养基的纯度。
   2. 冷冻电子显微镜
      1. 使用冷冻电子显微镜 （Cryo-EM） 确认新鲜、未裂解的 ADEV 悬浮液 （4 μL） 中 Evs 的存在和形态。使用 Holey 碳网格上的商用投入式冰箱对样品进行玻璃化，设置如下：3.9 μL 样品，等待时间 10 秒，印迹时间 2 秒。
      2. 在冷冻工作站中浸入液态乙烷-氮气中。将网格转移到保持在 -179 °C 的低温支架上进行透射电子显微镜分析。使用在 200 kV 加速电压下运行并配备 CCD 相机的透射电子显微镜检查 EV。使用软件采集显微照片。
5. 脂蛋白共沉淀分析
   1. 使用适用于商业自动分析仪的商业试剂盒，通过免疫比浊测定法测定未稀释血浆、裂解的总 EV 样品和裂解的 ADEV 样品中的人 ApoB 水平（有关详细信息，请参阅 材料表 ）。
6. ADEV 中炎症标志物的分析
   1. 使用基于磁珠的测定法（参见 材料表）定量 25 种炎症标志物的浓度：嗜酸性粒细胞趋化因子、IFN α2、IFN γ、IL-1 Alpha、IL-1 Β、IL-3、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12 （p40）、IL-12 （p70）、IL-15、IL-17A、IL-17E/IL-25、IL-17F、IL-18、IP-10、MCP-1、MCP-3、MDC、MIP-1 Alpha、MIP-1 Beta、TGF Alpha、TNF Alpha、TNF Beta。
   2. 使用裂解的未稀释 EV 制剂 （25 μL），并按照制造商的说明将样品与磁珠在 4°C 下孵育过夜。洗涤板，与 25 μL 检测抗体一起孵育，并在室温下搅拌孵育 1 小时。
   3. 向每个孔中加入 25 μL 链霉亲和素-PE，并在室温下孵育 30 分钟。加入 150 μL 鞘液，并在搅拌下孵育 5 分钟。在连接到系统的读板器上读取板。
      注：该技术基于使用与荧光包被的磁性微珠表面结合的抗体的免疫测定。该技术根据微球的颜色对不同染料进行内部编码。每种类型的微球都包被有特异性捕获抗体，因此多个偶联微球捕获包埋在样品中的分析物，从而可以同时对数十种分析物进行定量多重检测。该系统使用基于微珠的多重免疫分析平台进行信号检测⁴³。

3. 数据分析

1. 使用商业软件执行统计分析。使用 Shapiro-Wilk 检验评估数据正态性。检验 两组比较与 Mann-Whitney U 检验，三组比较 与 Kruskal-Wallis 检验和 Dunn 事后校正。将显著性设置为 p < 0.05。

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结果

从健康供体采集的血浆中分离 ADEV 已成功完成。采用基于聚合物的沉淀法获得总 EV 馏分，然后用磁性微珠进行免疫捕获以获得 ADEV。

在免疫捕获步骤之前对总 EV 组分的蛋白质印迹分析表明，EV 制剂中缺乏钙联结蛋白（细胞污染标志物）并且存在 Alix 和跨膜蛋白 CD9（图 2A）。

免疫捕获后，在 ADEV 组分中验证...

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讨论

由于其诊断和治疗潜力，电动汽车在生物医学研究中引起了浓厚的兴趣。目前，与 EV 分离方法相关的主要障碍之一是缺乏方法学共识和标准化方案。本研究为 通过 基于聚合物的沉淀和 GLAST 免疫捕获从人血浆中富集星形胶质细胞 EVs 提供了详细的方案。

存在不同的方法从体液中分离 EV，每种方法都有自己的优点和局限性。选择基于聚合物的方?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Alix primary antibody for Western blotting	EMD Millipore	ABC40
µMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-602	The µMACS Separator is used in combination with µ Columns and MACS MicroBeads.
Anti-calnexin primary antibody for Western blotting	Genetex	GTX109669
Anti-CD9 primary antibody for Western blotting	Cell Signaling	13174
Blocker BSA (10%) 200 mL	Thermo Fisher	37525
Bransonic 1510E-MT Ultrasonic bath	Branson
COBAS 6000 autoanalyzer	Roche Diagnostics		Analyzer for immunoturbidimetric determination of ApoB; commercial autoanalyzer
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-free)	Roche	11873580001
Digital Micrograph 1.8			micrograph software
Dulbecco's PBS Mg++, Ca++ free 500 mL	Thermo Fisher	14190144
EveryBlot Blocking Buffer	BioRad	12010020
Exoquick (exosome precipitation solution 5 mL) + Thrombin	System Bioscience	EXOQ5TM-1	ExoQuick 20 mL can also be purchased (EXOQ20A-1)
Gatan 895 USC 4000			camera
GeneGnome XRQ chemiluminiscence imaging system	Syngene
Human CD81 antigen (CD81) ELISA kit	Cusabio	CSB-EL004960HU
Human Programmed cell death 6-interacting protein (PDCD6IP) ELISA kit	Cusabio	CSB-EL017673HU
Immun-Blot PVDF Membrane	BioRad	1620177
JEOL 2011 transmission electron microscope	JEOL LTD		Equipped with a CCD Gatan 895 USC 4000 camera (Gatan 626, Gatan, Pleasanton, USA)
Lavender EDTA BD Vacutainer K2E tubes	Becton dickinson	367525
Leica EM GP	Leica Microsystem		commercial plunge freezer
Low binding microtubes 1,5 mL	Deltalab	4092.3NS
MACS µ Columns with plungers	Miltenyi Biotec	130-110-905	µ Columns with plungers are especially designed for isolation of exosomes from body fluids
MACS Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
MAGPIX plate reader	Luminex Corporation	80-073	Luminex's xMAP multiplexing unit (Luminex xPonent v 4.3 software)
MicroBead Kit100 μL Anti-GLAST (ACSA-1)-Biotin, human, mouse, rat – small size; 100 μL Anti-Biotin MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-095- 825
MILLIPLEX MAP Kit Human cytokine/Chemokine/Growth Factor Panel A magnetic bead panel	EMD Millipore	HCYTA-60K-25
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent 25 mL	Thermo Fisher	78503	For certain applications like Western blot, more aggressive lysis buffers can be used (e.g. RIPA)
MultiSkan SkyHigh Microplate Spectrophotometer	Thermofisher	A51119500C
NanoSight NS300	Malvern Panalytical		NTA; 3.4 version
Pierce Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail	Thermo Fisher	78441
Polypropylene syringe (G29)	PeroxFarma		1mL syringe; 0.33x12mm-G29x1/2"
Secondary anti-rabbit antibody	Thermo Fisher	10794347
Simoa GFAP Discovery Kit	Quanterix	102336
Simoa, SR-X instrument	Quanterix		SR-X Ultra-Sensitive Biomarker Detection System; commercial biomarker detection technology
Specific Protein Test Apolipoprotein B - APOB (100 det) COBAS C/CI	Roche Diagnostics	3032574122
SuperSignal West Femto	Thermo Fisher	34095	Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) HRP substrate
Trans-Blot Turbo Transfer System	BioRad	1704150