使用双极电极通过电点燃杏仁核创建颞叶癫痫小鼠模型

摘要

杏仁核在颞叶癫痫中起关键作用，颞叶癫痫起源于该结构并从该结构传播。本文详细介绍了具有记录和刺激功能的深部脑电极的制造。它介绍了源自杏仁核的内侧颞叶癫痫模型。

摘要

杏仁核是癫痫发作最常见的起源之一，杏仁核小鼠模型对于说明癫痫至关重要。然而，很少有研究详细描述实验方案。本文通过介绍双极电极的制作方法，阐述了杏仁核电点燃癫痫模型制作的全过程。该电极既可以刺激又可以记录，减少因植入单独的电极进行刺激和记录而引起的脑损伤。对于长期脑电图（EEG）记录目的，使用滑环来消除由电缆缠结和脱落引起的记录中断。

在基底外侧杏仁核（AP:1.67毫米，长:2.7毫米，V:4.9毫米）的周期性刺激（60Hz，每15分钟1秒）19.83±5.742次后，在六只小鼠中观察到完全点燃（定义为诱导三次连续V级发作按拉辛量表分类）。在整个点燃过程中记录颅内脑电图，点燃后观察到杏仁核癫痫放电持续20-70 s。因此，这是模拟源自杏仁核的癫痫的稳健方案，该方法适用于揭示杏仁核在颞叶癫痫中的作用。本研究有助于未来颞叶内侧癫痫的机制和新型抗癫痫药物的研究。

引言

颞叶癫痫（TLE）是最普遍的癫痫类型，具有转化为耐药性癫痫的高风险。手术，如选择性杏仁核海马切除术，是治疗TLE的有效方法，该病的癫痫发生和发作^{仍在研究中1，2}。TLE的发病机制已被证明不仅发生在海马体中，而且广泛存在于杏仁核^3，4中。例如，杏仁核硬化和杏仁核增大经常被报道为TLE癫痫发作的起源5^，6。杏仁核的重要性不容低估;杏仁核模型对于癫痫发生研究至关重要，迫切需要对该模型进行清晰的说明。

在动物模型中已经提出了几种诱导癫痫发作的方法。过去，惊厥药物在早期阶段腹膜内注射^7。虽然这种方法很方便，但癫痫病灶的位置尚不确定。随着立体定向技术和详细的动物脑图谱的发展，应用颅内药物注射解决了定位问题⁸。然而，在急性期缺乏对严重癫痫发作的干预导致高死亡率，慢性自发性癫痫发作伴有发作间期不稳定和癫痫^{发作频率不稳定}的问题9^，10。最后，开发了电点火方法;该方法周期性地多次刺激特定的大脑区域，允许在明确控制位置和发病时间的情况下诱导癫痫发作¹¹。

这种方法的一个优点是电极的颅内植入是微创的¹²。此外，癫痫发作的严重程度可以通过刺激的终止来控制，从而降低癫痫发作引起的死亡率。这些变化解决了以前方法的缺点。值得注意的是，该模型可以充分模拟人类癫痫发作，并且特别适合癫痫持续状态（SE）的研究，因为它能够快速诱导^SE13。它还可用于抗癫痫药物筛选¹⁴ 和癫痫机制的研究。最后，众所周知，杏仁核与记忆调节、奖励处理和情绪密切相关¹⁵.癫痫患者经常遇到这些精神功能的障碍，因此，杏仁核癫痫模型可能是研究癫痫情绪问题的更好选择¹⁶。

研究方案

该实验得到了首都医科大学宣武医院实验动物伦理委员会的批准。所有小鼠均在首都医科大学宣武医院动物实验室保存。该协议分为四个部分。前两部分介绍了使用滑环连接电极和脑电图记录/刺激设备的电极和电路的构建方法。第三部分描述了电极植入的操作方法，第四部分介绍了用于杏仁核癫痫模型的脑电记录和刺激参数。

1. 电极的制造

1. 准备好以下先前准备好的材料:两根 3 厘米长的特氟龙涂层钨丝（裸直径:76.2 μm）、一根相同长度的银线（裸直径:127 μm）和一组 2 x 2 规格排针。
2. 使用打火机燃烧每根钨丝的一端，以去除 5 毫米的绝缘涂层。
   注意:去除绝缘层的钨丝变黑;钨丝的这一部分被称为上端。
3. 剥下一段超细多股线，从底部到上端缠绕，在那里它开始变黑，继续到顶部。通过捏住一端并轻轻扭转另一端，将这种超细线（具有柔软的质地）与钨丝结合，这使得两种材料可以轻松地缠绕在一起。
4. 轻轻拉动以确保它们被紧紧包裹并切断多余的超细电线。在整个过程中尽量保持钨丝笔直。
5. 将排销固定在焊接台上的夹子上，销的较长一侧朝外。使用注射器针头捡起一些焊膏并将其涂在引脚上。将焊枪加热至320°C;用割炬尖端熔化并涂抹一些无铅锡丝。
6. 将钨丝的上端与排针的一根针重叠，并使用割炬上的焊料将钨丝粘合到引脚上。
   注意:如果没有超细线的帮助，直接将钨丝与引脚焊接是非常困难的。
7. 以相同的方式将另一根钨丝和另一根银线焊接到行销上，使每根线对应于一根针（见 图1，i）。
8. 切割两根比钨丝上端稍长的热缩管。将它们放在两根钨丝的焊点上，确保导电部分完全覆盖在管中，使两根钨丝的电路不串联放置。
   注意:虽然有三根电线，但如果其中两根是绝缘的，三根电线将不会串联;也可以在银线上添加一根管子。
9. 从焊接台夹上取下电极，用大钳子轻轻握住电极，因为在加热热缩管时电极容易变形，使用导热性好的夹具，用力稍大。
10. 打开风管并加热，直到达到 320 °C 的温度。吹气热缩管几秒钟，直到其拧紧（见 图1，ii）。
11. 如果在焊接过程中针头与塑料主体分离，请用热熔胶拼接焊接部件和塑料主体（见 图1，iii）。注意不要将其涂抹在接口上，因为这会影响接口插入。
12. 握住两根钨丝并将它们扭在一起，使它们的两端分开（见 图 1，iv）。将双绞钨丝修剪至约 10 毫米长，使两端的间距不超过 0.5 毫米。
    注意:此步骤也可以在电极植入之前执行，以便灵活调整电极长度。
13. 加热胶枪并将胶水均匀地涂在电极周围。
14. 用万用表检查电极:将万用表的一根棒放在排针的未焊接侧，轻轻地将钨丝或银线的末端接触另一根，检查电路是否光滑。确保线条未串联放置。

2. 滑环连接及电路说明

注意:当小鼠上的电极在自由移动的状态下通过电缆 插入 EEG设备时，随着小鼠的移动和转动，电缆可能会缠结在一起。这会导致电缆变短，最终阻碍小鼠移动或导致电缆从头上掉下来。在这里描述的方法中，引入了一个四通道滑环以防止电缆脱落。四个通道在 图1B中以四种颜色表示。

1. 在两端撕下 5 毫米的绝缘皮，露出里面的金属线。
2. 在每根定子线上添加一段热缩管。
3. 用EEG设备连接器插头焊接每根电线。
4. 用热空气收缩热缩管。
5. 在每根转子线上添加一段热缩管。
6. 将红色和橙色电线的导电部件拧在一起，并将它们焊接到针座中的接头上以适合行销。
7. 将接头上的其他两根电线焊接到每个接头上。
   注意:对应于银线的棕色通道连接到EEG设备以进行接地。红色和橙色通道接收来自同一根钨丝的信号，橙色通道用作EEG设备的参考。红色通道中的信号毫无意义，但它们必须与黑色通道共存才能形成电流刺激。黑色通道中的信号是大脑中的真实电信号。不同的电路可以设计多通道滑环，以适应不同的设备。

3. 植入手术

1. 动物
   1. 使用8周龄的C57BL / 6野生型雄性小鼠，重24-26g，进行手术。
   2. 将它们安置在温度受控环境（22±1°C）中12小时明暗循环（光照时间:8:00-20:00），并 随意提供水和饲料。
   3. 在手术过程中使用额外的加热垫来保持动物温暖。
   4. 手术后，皮下注射美洛昔康（10mg / kg）作为镇痛药的第一次给药。然后，将动物放在单独的笼子中以优化恢复。手术后第一周将美洛昔康添加到动物的饮食中。
   5. 实验结束后，在麻醉下向小鼠的左心室注入4%多聚甲醛，并收集脑组织以对电极靶标进行组织学验证。
2. 称量小鼠并通过腹膜内注射1%戊巴比妥溶液麻醉。通过高压灭菌对所有要使用的手术器械和耗材进行消毒，包括钻头、电极、牙科水泥等。
3. 当鼠标完全麻醉后，用剃须刀将头发从眼睛剃到耳朵区域。
4. 将鼠标固定在立体定位框架上。将前上牙放入门牙杆，并将两个耳杆均匀地深深插入耳朵。将红霉素眼膏涂抹在眼睛上，以防止手术过程中因强光而引起的干燥和失明。
5. 用三支碘伏和75%酒精的交替拭子以圆周运动对手术区域进行消毒。然后，从该切口的中间向前做一个矢状切口，并切掉切口两侧的皮肤以创建一个三角形窗口。
6. 将一小块棉花卷成球状，用3%的过氧化氢润湿。用小棉球轻轻摩擦暴露区域，直到清晰地看到前囟门和后囟门，以去除附着在颅骨上的软组织。
7. 调整前后高度，使前囟门和后囟处于水平位置。将前囟门的位置视为轴的原点。
8. 将不锈钢螺钉固定在左小脑头骨上，使用钻头形成平坦的表面。确保螺钉突出颅骨一半。
9. 确保杏仁核点燃的坐标距后侧 −1.67 毫米、横向坐标和距前侧点 −4.9 毫米腹侧坐标。调整立体定位装置以定位该点并标记它。
10. 用直径为0.5毫米的颅骨钻在标记点上钻一个孔。
11. 将电极固定在立体定位装置的定位杆上，将电极垂直放置在孔上方，然后将位置缓慢降至 −4.9 mm。将银线缠绕在螺钉上三次，注意在操作过程中不要晃动电极体。
12. 混合牙科水泥并将其轻轻涂抹在电极和颅骨表面。当牙科水泥硬化时，修改外部，直到包围固定电极的水泥变成锥体。
13. 当水泥硬化后，将电极从立体定位装置中释放出来。皮下给予美洛昔康10mg/kg，以缓解动物疼痛引起的不适。在手术后第一周将美洛昔康施用于动物性食物以产生镇痛作用。取出鼠标并将其放回笼子中，将其与其他小鼠分开。

4. 电火

1. 在点燃之前，让小鼠在手术后休息至少 1 周，以便术后恢复并让炎症消退。
   注意:一般来说，没有充分恢复的老鼠对点燃反应不佳。
2. 将鼠标放入定制的盒子中，滑环电缆连接鼠标头上的电极和脑电图设备。将电缆穿过盒子盖上的一个孔，并调整盒子中剩余的长度，让鼠标自由移动。
3. 打开脑电图设备并检查其是否正常工作。将刺激器设置为在 1 秒的列车持续时间内以 60 Hz 提供 1 ms 单相方波脉冲。
4. 第一次刺激的电流强度为50μA;监测出院后的脑电图，其特征是高频尖峰。如果没有观察到放电后，则向下一个刺激物添加25μA，并每10分钟继续此过程，直到观察到放电后并持续5秒。
   注意:如果实验不需要放电，则可以跳过步骤4.4;300 μA 的强度足以点燃。
5. 每15分钟用步骤4.3中确定的电流强度刺激小鼠，每天不超过20次。
6. 监测对刺激的行为反应。
   注意:连续三次V级发作的发生被认为是完全点燃的，结合拉辛等级标准¹⁷。

结果

电极和电路能够记录脑电图并起到刺激作用（图1）;这种设置避免了分别植入记录和刺激电极的复杂性，并最大限度地减少了对脑组织的损害。滑环的应用允许电极与所有类型的设备连接。

我们对6只健康的成年雄性C57BL / 6小鼠进行了电极植入手术，并在手术后2周进行了电刺激。行为癫痫发作水平随着刺激次数的增加而逐渐增加，分级基于拉辛量表:1 =口...

讨论

癫痫是一组表现多样、病因多样的疾病¹⁸;应该注意的是，没有单一的模型可以用于所有类型的癫痫，研究人员必须为他们的特定研究选择合适的模型。本研究介绍了一种最容易获得的电极制造方法。该方法的各个部分可以进行调整以适应不同的实验条件。

该方法利用具有刺激和记录功能的电极，减少了植入单独的电极进行刺激和脑电图记录对动物大脑造成?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488-conjugated Donkey anti-Rabbit IgG	invitrogen	A-21206
c-Fos antibody		ab222699
Cranial drill	SANS	SA302
dental cement	NISSIN
EEG recording and stimulation equipment	Neuracle Technology (Changzhou) Co., Ltd	NSHHFS-210803
lead-free tin wire	BAKON
Pin header/Female header	XIANMISI		spacing of 1.27 mm
Silver wire	A-M systems	786000
Slip ring	Senring Electronics Co.,Ltd	SNM008-04
Tungsten wire	A-M systems	796000
ultrafine multi-stand wire	Shenzhen Chengxing wire and cable	UL10064-FEP
welding equipment	BAKON	BK881