体外选择核酸适配体以区分感染性和非感染性病毒

摘要

我们提供的方案通常可以应用于选择仅与感染性病毒结合的适配体，而不应用于通过消毒方法或任何其他类似病毒变得非传染性的病毒。这为在便携式和快速检测中确定感染性状态提供了可能性。

摘要

病毒感染对社会有重大影响;大多数检测方法难以确定检测到的病毒是否具有传染性，导致治疗延误和病毒进一步传播。开发能够告知临床或环境样本可感染性的新型传感器将应对这一未满足的挑战。然而，很少有方法可以获得能够识别完整传染性病毒并将其与通过消毒方法变得非传染性的同一病毒区分开来的传感分子。在这里，我们描述了一种选择适配体的方案，该适配体可以通过指数富集（SELEX）对配体进行系统进化来区分感染性病毒和非感染性病毒。我们利用了SELEX的两个功能。首先，SELEX 可以量身定制，以使用计数器选择来去除竞争目标，例如非传染性病毒或其他类似病毒。此外，整个病毒可以用作SELEX的靶标，而不是例如病毒表面蛋白。全病毒SELEX允许选择与病毒天然状态特异性结合的适配体，而无需破坏病毒。因此，该方法允许基于病原体表面的功能差异获得识别剂，而不需要事先知道。

引言

病毒感染在世界各地具有巨大的经济和社会影响，最近的COVID-19大流行越来越明显。及时准确的诊断对于治疗病毒感染同时防止病毒传播给健康人至关重要。虽然已经开发了许多病毒检测方法，例如PCR测试¹，²和免疫测定^3，但目前使用的大多数方法都无法确定检测到的病毒是否真的具有传染性。这是因为仅存在病毒成分（例如病毒核酸或蛋白质）并不表明存在完整的传染性病毒，并且这些生物标志物的水平与^{感染性相关性}较差4，^5，6。例如，通常用于当前基于 PCR 的 COVID-19 测试的病毒 RNA 在感染的早期阶段患者具有传染性时水平非常低，而当患者从感染中康复并且不再具有传染性时，RNA 水平通常仍然很高^7，8.病毒蛋白或抗原生物标志物遵循类似的趋势，但通常比病毒RNA出现得更晚，因此更不能预测感染^性6，9。为了解决这一限制，已经开发了一些可以告知病毒感染状态的方法，但基....

研究方案

1. 试剂和缓冲液的制备

1. 通过加入 0.9 M 三硼碱、0.9 M 硼酸、20 mM EDTA（二钠盐）和去离子水至最终体积为 1 L 来制备 10x 三硼酸盐 EDTA（10x TBE）。
2. 制备10%变性聚丙烯酰胺储备溶液，如下所示。在 250 mL 玻璃瓶中，加入 120 g 尿素 （8 M）、25 mL 10x TBE、62.5 mL 40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 （29：1） 溶液和足够的蒸馏水以达到 250 mL 的最终体积。混合直至所有成分溶解。
3. 准备2x上样缓冲液，如下所示。在 50 mL 管中，加入 21.636 g 尿素 （8 M）、1.675 g EDTA （1 mM） 和 4.5 mL 10x TBE。用蒸馏水填充至 45 mL 并混合直至所有组分溶解。
4. 通过加入100mM乙酸钠和1mM EDTA（二钠盐）制备提取缓冲液。将最终pH值设置为5。
5. 按如下方式制备乙醇沉淀溶液。制备3 M乙酸钠，调节至pH 5.2，并储存在4°C。 制备70%乙醇v / v并储存在-20°C。 制备100%乙醇并储存在-20°C。
6. 制备 500 mL 含有 1x PBS、2.5 mM 氯化镁 2 和 0.5 mM 氯化钙₂ 的 SELEX 缓冲液。调节至 pH 7.4。通过添加 1x PBS、2.5 mM 氯化镁 2、0.5 mM 氯化....

结果

由于DNA适配体可以在试管¹⁵中使用SELEX获得，因此该SELEX策略经过精心设计，既包括针对完整全传染性病毒的正向选择步骤（即保留与感染性病毒结合的DNA分子），也包括针对通过特定消毒方法变得无感染性的同一病毒的反选择步骤， 特别是紫外线处理，通过丢弃可以与非感染性病毒结合的DNA序列。选择过程的示意图如图 1所示。

作为?.......

讨论

SELEX不仅可以鉴定pM-nM范围^为22，^43，44，⁴⁵的高亲和力适配体^，还可以鉴定具有高可调选择性的适配体。通过利用计数器选择，可以获得具有具有挑战性选择性的适配体。例如，Li小组已经证明能够获得能够区分致病性细菌菌株和非致病菌株的序列²¹。此外，Le等人鉴定出一种能够区分<.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Ammonium persulfate (APS)	BioRad	1610700
100% Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
1x PBS without calcium & magnesium	Corning	21-040-CM
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution	BioRad	1610146
Agencourt AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63880	DNA clean-up beads - Section 7.2.2
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Merck	UFC501024	cut-off 10 kDa
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Merck	UFC510024	cut-off 100 kDa
Boric Acid	Sigma-Aldrich	100165
C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module	BioRad	1851148
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C4901
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	BioRad	1855201
Digital Dry Baths/Block Heaters	Thermo Scientific	88870001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	Thermo Fisher	65001	streptavidin-modified magnetic beads - Section 4.9
EDTA disodium salt	Sigma-Aldrich	324503
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	T9661	1.5 mL
Lenti-X p24 Rapid Titer Kit	Takara Bio USA, Inc.	632200	Lentivirus quantification kit - Section 3.3.2.1
MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube	Thermo Scientific	MR02
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical	BioRad	MSB1001	non-UV absorbing
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels	BioRad	1658004EDU
Mini-PROTEAN Short Plates	BioRad	1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers	BioRad	1653310
Molecular Biology Grade Water	Lonza	51200
Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear	BioRad	MLP9611
Nanodrop One	Thermo Scientific	ND-ONE-W
OneTaq DNA Polymerase	New England BioLab	M0480S
Ovation Ultralow v2 + UDI	Tecan	0344NB-A01	High-troughput sequencing library preparation kit - Section 7.2.
PIPETMAN G (100-1000 µL, 20-200 µL, 2-20 µL and 0.2-2 µL)	Gilson	F144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets	Labconco	4261
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Invitrogen	Q32850	fluorescence-based  dsDNA quantification  kit - Section 7.2.3
SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL)	Thomas Scientific	1158U43, 1159M44, 1158U40
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002440
SsoFast EvaGreen Supermix	BioRad	1725201	qPCR mastermix - Section 6.2.
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma-Aldrich	T1503
Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8	USA scientific	AB1183	PCR tubes
Urea	Sigma-Aldrich	U5128