蜜蜂组织中的组织学基础和细胞死亡检测

摘要

免疫组织化学方法可用于蜜蜂研究，以检测和评估成年蜜蜂中肠和下咽腺的细胞凋亡和坏死水平。

摘要

蜂巢内（护士和其他蜂巢蜜蜂）和蜂巢外（觅食者）的蜜蜂（Apis mellifera L.）暴露于气候和天气变化，各种杀虫剂，病原体和营养不良，主要通过口腔进入，主要影响成年蜜蜂的消化道。为了了解和防止这种外部和内部压力源对蜜蜂的影响，一种有用的研究方法是免疫组织化学方法。描述了准备成年蜜蜂的中肠（脑室）和下咽腺（HPG）以进行组织学分析的基本方案。描述了一种详细的方法来评估细胞损伤水平，并将坏死与作为组织再生自然过程的程序性细胞死亡（细胞凋亡）区分开来。介绍了用草酸和杀虫剂（杀虫剂和杀螨剂）处理成年蜜蜂的结果以及脑室和HPG中细胞死亡的测定。还讨论了该方法的优缺点。

引言

蜜蜂（Apis mellifera L.）是其他野生传粉媒介，也是农业植物最重要的传粉媒介。几千年来，不断变化的环境影响了蜜蜂调整其形态、生理、行为和对几种病原体和寄生虫的耐受性。因此，蜜蜂在全球范围内发展出高度多样化的物种和亚^种1。这些结果与先前的发现一致，即蜜蜂的消化道结构存在遗传变异，但也表明中肠的改变是由于环境因素^2，3。

蜜蜂的消化道有三个主要部分:前肠、中肠（脑室）和后肠⁴。脑室是消化花粉和花蜜/蜂蜜的重要器官;在后肠中，渗透控制是通过吸收水和离子²进行的。蜜蜂工人的下咽腺（HPG）位于头部，合成和分泌蜂王浆成分，以喂养育雏，蜂王和蜂群成员。它们的大小随着年龄和任务而变化，并取决于适当的营养（优质花粉）。6至18天的护士进行育雏，HPG的大小增加^5，6。在觅食蜂中，HPGs退化并仅分泌对将蜂蜜中的复杂糖转化为简单糖（α-葡萄糖苷酶，亮氨酸芳基酰胺酶，转化酶）很重要的^酶7。

蜜蜂暴露于几种生物和非生物应激源⁸，消化道可能受到几种负面兴奋剂的影响。保护生物体免受病原体侵害的第一道屏障是中肠的周养膜，它由肠粘膜组成，以防止病原体⁴。HPG 的发育和功能取决于饮食、年龄和菌落条件⁹，并受到杀虫剂、杀螨剂¹⁰ 和病原体¹¹、^12、13 的影响。由于瓦罗亚控制处理和来自环境的杀虫剂，蜂巢中的杀螨剂残留会影响觅食蜂和护士蜂^14，15。对蜜蜂群体的最大威胁是螨虫Varroa破坏者，既是导致蜂群损失的病毒载体¹⁶，也是宿主肥胖身体（蜜蜂的重要重要器官）的消费者，因此会影响个体的身体和群体功能¹⁷。

然而，集约化的农田栖息地可以为蜜蜂提供短期的食物供应。因此，农业环境计划应提高农业景观中蜜花的供应¹⁸.为了评估^不同亚种6，¹⁹，²⁰，²¹的形态或这些因素在细胞或组织水平上的亚致死作用^，特别是中肠和HPG，组织学和免疫组织化学方法是实用的，并且足够准确^，可用于蜜蜂的组织学研究。

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研究方案

1. 蜜蜂研究的基础组织学

1. 蜜蜂组织解剖
   注意:要解剖工蜂，请使用带LED光源的解剖显微镜。最有用的放大倍率是~20倍。
   1. 操作和解剖
      1. 小心地用镊子取一只工蜂，并将其放在冰上（或放入-20°C的冰箱）2分钟以固定²²。将蜜蜂斜着固定在培养皿上，从左到右和从右到左两次穿过胸部的最上部。
      2. 倒入昆虫盐水覆盖身体。将培养皿放在显微镜下，聚焦并调整。
      3. 准备仪器（见 材料表）。
   2. 中肠解剖
      1. 从腹部开始，在蜜蜂身体右侧中心的 tergite A5（图 1）下方插入剪刀的一个点。切到特吉特 A2。
      2. 保持剪刀内刃与身体侧面平行，以免损坏内脏。将剪刀向左转，剪一剪;右转并再次切割。轻轻打开腹部的左侧并固定。在另一侧重复。
      3. 用一只手用镊子轻轻向上拉蜜蜂胃，另一只手用剪刀在食道的最末端剪开。将胃和中肠从腹部拉开，并在直肠处切开。使用带有昆虫盐水溶液的移液管，并去除任何粪便或组织部分。
   3. 解剖高分子气质激素
      1. 按照步骤1.1.1所述将工蜂固定在冰上。切下头部并将其放在较小的板上，触角朝上。用两个销钉固定头部:一个穿过左复眼，第二个穿过右复眼。
      2. 在针脚内侧的第一个复眼上切开，继续切到盂唇，然后在另一侧穿过第二个复眼进行另一切口（图2）。
      3. 切断触角。取下面膜，切下仍附着的地方。拿起镊子，小心地去除腺体以及大脑和部分复眼。
2. 固定、脱水和石蜡包埋
   注意:戴防护手套。
   1. 将组织放入青霉素瓶中，用10%福尔马林填充3/4。保存在4°C的冰箱中。
   2. 24小时后，在一系列醇中脱水组织:70%，80%，90%，100%，每个1小时，100%2-丙醇1小时，100%2-丙醇12小时，最后100%2-丙醇1小时。
   3. 将组织放入组织盒中;标记并将它们放入玻璃室中，用2-丙醇和石蜡（1:1）在60°C的培养箱中放置24小时。
   4. 将组织盒移至另一个装有石蜡（I.）的腔室中24小时。用新鲜石蜡重复该过程两次（II.和III.），均为24小时。
   5. 最后，准备安装站并开始将组织嵌入蜡中。
      1. 打开每个历史盒并取下盖子。用蜡填充模具，并小心地将带有温镊子的组织放在模具中间。
      2. 将组织盒放在模具上，并用蜡轻轻覆盖。立即将模具放在安装站的冷表面上几秒钟，然后将其放在冷板上几分钟，直到蜡变硬并与模具和组织盒一起分离。
   6. 将完成的样品存放在盒子中，远离灰尘和热量。
   7. 在切片机上切割4μm薄片:首先，两个切片相互连接，然后一个分开。用镊子转移切片并让它们漂浮在蒸馏水（42°C）上，然后将它们收集在干净的载玻片上，将两个部分放在物镜的左侧，第三个部分放在右侧，保持明显分开。将标记的载玻片在加热设备上过夜，最后将它们存放在专用于组织学样品的盒子中。
3. 脱蜡和补水
   注意:戴防护手套。
   1. 准备九个科普林罐，并将切片放入一系列清除剂（I.，II.，III.）中，每个5分钟。
   2. 放入2-丙醇、乙醇96%（I.，II.）、酒精90%和80%和蒸馏水各3分钟。
4. 用苏木精和伊红染色
   注意:戴防护手套。
   1. 准备六个科普林罐。
   2. 对于苏木精和伊红（H&E）染色，将脱蜡，再水化的切片放入苏木精中5分钟，然后小心地将它们放在流动的自来水中2分钟。然后将它们放入蒸馏水中1分钟，伊红4分钟（对于伊红，不需要Coplin罐）。
   3. 将载玻片置于96%乙醇中1分钟，然后2-丙醇放置2分钟，最后放入清除剂中2分钟。
   4. 加入安装介质和盖玻片，让它们干燥。在光学显微镜下观察。

图1:蜜蜂身体的背视图。 A1-A7 三分。有关蜜蜂解剖的详细说明可以在Carreck等人²⁴中找到。 请点击此处查看此图的大图。

图2:HPG的背视图，复眼的一部分附着在大脑上（不可见）。 一只 5 到 6 天的年轻工蜂有丰满和乳白色的 HPG。腺泡位于大脑上，并用到达大脑后部的分支填充头部区域。在觅食的蜜蜂中，这些腺体大大缩小，只留下细线状的残骸。出于这个原因，最好将腺体与大脑一起切除，以便在进一步的手术中更容易避免失去组织。比例尺 = 500 μm。 请点击此处查看此图的大图。

2. 组织切片细胞死亡检测

1. 细胞凋亡检测试剂盒（检测A）
   注意:请遵循制造商的协议（请参阅 材料表）。
   1. 准备科普林罐。
   2. 脱蜡和再水化后（参见步骤1.3），将载玻片浸入0.85%NaCl溶液中，然后浸入磷酸盐缓冲盐水（PBS）（5分钟）。
   3. 将载玻片放入4%多聚甲醛中2 x 15分钟。
   4. 将载玻片平放在容器中，加入 100 μL 蛋白酶 K （20 μg/mL） 溶液，然后放置 10-30 分钟。
   5. 将载玻片放入PBS（5分钟）。
   6. 将载玻片放入PBS中的4%多聚甲醛中（5分钟）。
   7. 将幻灯片浸入PBS中（2 x 5分钟）。
   8. 将载玻片平放在容器中，加入 100 μL 平衡缓冲液，静置 5-10 分钟。
   9. 加入 100 μL TdT 反应混合物。将纸巾放在容器内，在载玻片周围，用水润湿毛巾，然后用保鲜膜盖住。将载玻片在37°C孵育60分钟。
   10. 将载玻片放回染色架中，浸入2x盐水 - 柠檬酸钠（SSC）中15分钟。
   11. 将载玻片浸入PBS中3 x 5分钟，然后在0.3%过氧化氢中浸入3-5分钟，然后再次浸入PBS中，3 x 5分钟。
   12. 再次，将载玻片平放在容器中，加入 100 μL 链霉亲和素 HRP（辣根过氧化物酶），静置 30 分钟（用保鲜膜覆盖）。
   13. 将载玻片浸入PBS中3 x 5分钟。
   14. 将载玻片平放在容器中，加入 100 μL 3，3'-二氨基联苯胺 （DAB） 溶液。寻找浅棕色背景。
   15. 将载玻片放回架子上，在水中清洗几次（双蒸）。
   16. 将载玻片安装在安装介质中的玻璃盖玻片下，并平放晾干。
   17. 在光学显微镜下观察。
2. 细胞凋亡检测试剂盒（检测 B）
   注意:请遵循制造商的协议（请参阅 材料表）。
   1. 准备科普林罐。
   2. 制备蛋白酶K（在PBS中稀释的20μg/ mL）。
   3. 脱蜡和再水化切片（步骤1.3）后，将载玻片放入PBS中5分钟。
   4. 将载玻片平放在容器中，加入蛋白酶K（20μg/ mL，每5cm²样品60μL）。
   5. 在蒸馏水中清洗载玻片2 x 2分钟。
   6. 在室温下在内源性过氧化物酶（3%氢过氧化物酶中）中淬灭。
   7. 用PBS或水冲洗载玻片2 x 5分钟。
   8. 将载玻片平放在容器中，并在室温下应用平衡缓冲液（75μL / 5 cm²）10秒。
   9. 小心地擦拭纸巾周围。
   10. 向每个部分加入TdT酶（末端脱氧核苷酸转移酶），并在37°C下在加湿室中孵育1小时。 将纸巾放在托盘内，在幻灯片周围，用水润湿毛巾，并用保鲜膜盖住。
   11. 孵育后，将标本放入架子中，并将其留在停止/洗涤缓冲液中（10分钟）。
   12. 将抗地高辛偶联物加热至室温。
   13. 在PBS中清洗载玻片（3 x 1分钟）。
   14. 小心地擦拭纸巾周围。
   15. 向切片中加入两滴抗地高辛-过氧化物酶偶联物（65μL / 5cm²），并在加湿的容器中孵育30分钟。
   16. 在PBS中洗涤4 x 2分钟后，制备工作强度的过氧化物酶底物，轻轻敲击多余的液体并在切片周围吸出。
   17. 用过氧化物酶底物（75μL / 5cm²）覆盖切片并染色5分钟。将载玻片放在显微镜下并确定最佳染色时间。
   18. 在蒸馏水中的染色架中清洗载玻片（3 x 1分钟）。
   19. 将载玻片在蒸馏水中孵育5分钟。
   20. 使用苏木精复染2分钟。
   21. 将载玻片放在流动的自来水中3分钟。
   22. 用蒸馏水清洗载玻片。
   23. 将载玻片安装在安装介质中的玻璃盖玻片下，并平放晾干。
   24. 在光学显微镜下观察。
3. 细胞凋亡检测试剂盒（检测C）
   注意:请遵循制造商的协议（请参阅 材料表）。
   1. 准备科普林罐。
   2. 对组织切片进行脱蜡和再水化（见步骤1.3）。
   3. 用蛋白酶K孵育组织（在37°C下孵育15-30分钟）。
   4. 将载玻片放回架子上，在PBS中冲洗2次。
   5. 盖上 50 μL 的"TUNEL 反应混合物"。将湿纸巾放入容器内，用保鲜膜覆盖，并在37°C下放置60分钟。
   6. 用 PBS 冲洗 3 次。
   7. 将载玻片放入容器中并干燥组织样品周围的区域。
   8. 向样品中加入 50 μL 转换器-AP，并在 37 °C 下在加湿容器中孵育 30 分钟。
   9. 在PBS中冲洗3次。
   10. 加入 50-100 μL 底物溶液，在黑暗中放置 10 分钟。
       注意:在光学显微镜下观察染色。
   11. 用PBS冲洗载玻片3次。
   12. 通过将切片转移到苏木精中2分钟，然后在流动的自来水中仔细冲洗5分钟来进行复染。
   13. 将载玻片安装在水性封片介质中的玻璃盖玻片下，并使其平放干燥。
   14. 在光学显微镜下观察。通过在光学显微镜下计数中肠或HPG的每个样品中的70至100个细胞来评估受影响的（阳性）细胞。

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结果

中肠细胞死亡检测
来自卢布尔雅那斯洛文尼亚农业研究所实验养蜂场的新出现的工蜂（Apis mellifera carnica）用3%草酸（OA）单独处理²³。OA经常用于养蜂业，用于 瓦罗阿析构函数 控制。治疗后，将工蜂（每组三只）固定在冰上。解剖中肠并将其固定在10%福尔马林中。然后将组织在一系列酒精溶液中脱水，最后包埋在石蜡中。用切片机切成7μm薄片后，制?...

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讨论

在生物体中，细胞死亡被定义为细胞凋亡或坏死²⁵，并可伴有自噬²⁶。凋亡细胞和坏死细胞之间的区别在于，细胞凋亡是程序性细胞死亡的一种形式，出现在正常细胞中，而坏死是由于致命条件（例如，事故，疾病）而发生的^27，28。可以使用基于TUNEL技术的检测试剂盒检测细胞凋亡（通过在细胞凋亡过程中产生的双链D...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol
ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection)	Sigma-Aldrich	S7100	Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101
Covers
DeadEnd Colorimetric TUNEL system	Promega	G7360	Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360
Dissecting microscope  (for bee dissection)	Zeiss
Distilled water
Embedding cassette
EnVision System alkaline phosphatase kit	Dako
Eosin Y Solution	Sigma-Aldrich		alcoholic
Ethanol			95% (or less pure), 90%, 80%
Faramount mounting medium, aqueous	Dako		mounting medium
Flattening table	Leica	HI1220
Forceps  (for bee dissection)	Fine science tools	11294-00	Standard #4
Formalin 10%			Formaldehyde
Hematoxylin	Sigma-Aldrich
HistoChoice Clearing Agent	Sigma-Aldrich		clearing agent
Hydrogen peroxidase 3%
Incubator	BioRad
Insect pins  (for bee dissection)	Entosphinx	44594	Insect pins stainless steel – white, size 2
ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase)	Roche	11684809910	Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf
KH2PO4
Lab clock
Light microscope	Leica
Microscope slides			Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust
Microtome	Leica
Modular tissue embedding station	Leica
Na2HPO4
NaCl
Paraformaldehyde 4%
Paraplast	Leica
Pasteur pipettes			1.5 mL; 3 mL
PBS
Petri dish  (for bee dissection)			Filled with condensation silicon  (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator)
Proteinase K	Merck	21627
Ringers' solution  (for bee dissection)			7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water
Scissors  (for bee dissection)	Fine science tools	1406-09, 14061-09	Straight and curved, 9 cm
Universal liquid plus activator  (for bee dissection)	Kulzer
Watchmaker’s forceps (for bee dissection)	Fine science tools	91100-12
Water bath	Leica
Watercolor brush			2x
Xantoprene L blue  (for bee dissection)	Kulzer