用于黑腿蜱、肩突硬蜱基因编辑的胚胎注射技术

摘要

本协议描述了一种注射蜱虫胚胎的方法。胚胎注射是遗传操作产生转基因系的首选技术。

摘要

蜱虫可以传播各种病毒、细菌和原生动物病原体，因此被认为是具有医学和兽医重要性的载体。尽管蜱传疾病的负担越来越大，但由于将遗传转化工具应用于功能研究蜱的独特生物学的挑战，对蜱虫的研究仍然落后于昆虫病媒。遗传干预在减少蚊媒疾病方面越来越受到关注。然而，这种干预措施的发展需要通过注射胚胎来稳定地转化种系。螯合物（包括蜱虫）缺乏这种胚胎注射技术。几个因素，例如蜱胚胎上的外部厚蜡层、硬绒毛膜和高卵内压力，是以前阻碍蜱虫胚胎注射方案发展的一些障碍。目前的工作已经克服了这些障碍，这里描述了一种用于黑腿蜱（ 肩突硬 蜱）的胚胎注射技术。该技术可用于递送组分，如CRISPR/Cas9，以实现稳定的种系转化。

引言

蜱是具有医学和兽医重要性的载体，能够传播各种病毒、细菌、原生动物病原体和线虫^1，2。在美国东部，黑腿蜱，肩突硬蜱，是莱姆病（LD）病原体伯氏螺旋体伯氏疏螺旋体的重要载体。美国每年报告的LD病例超过40万例，使其成为美国最大的媒介传播传染病¹。除伯氏双歧杆菌外，肩突双歧杆菌还传播其他六种微生物，包括四种细菌（嗜吞噬细胞无形体、蛋黄孢杆菌、宫本双歧杆菌和穆氏埃立克体）、一种原生动物寄生虫（小巴贝虫）和一种病毒（波瓦桑病毒），使这种蜱虫物种成为主要的公共卫生问题³ .虽然近年来蜱传疾病变得越来越普遍，但由于蜱的独特生物学以及与应用遗传和功能^{基因组工具相关的}挑战，对蜱虫的研究已经落后于其他节肢动物媒介，如蚊子4^，5。

基因编辑技术，特别是CRISPR / Cas9，现在已经使功能基因组学研究在非模式生物中变得可行。为了在生物体中产生可遗传的突变，胚胎注射仍然是递送改变

研究方案

肩突硬蜱 成虫要么从俄克拉荷马州立大学（OSU）购买，要么在内华达大学里诺分校（UNR）饲养（IACUC协议#21-001-1118）。

1. 制备用于胚胎采集的雌性蜱虫

注意：要收集适当年龄的卵子，同步产卵很重要。虽然蜱虫的产卵线索尚不清楚，但在标准昆虫条件下（27°C温度和>90%相对湿度（RH））， 肩突蜱 雌性在宿主脱离后约8天开始产卵。该时间表可以通过在4°C下储存充满雌性来延长。 我们将血液喂养的雌性储存在4°C长达8周，对产卵没有任何负面影响。对于每种昆虫，可能需要修改这些条件。

1. 将所有充满的雌性储存在4°C，>90%RH中，内衬有湿滤纸的6夸脱塑料盒中，直到用于显微注射。
2. 注射前一周，将雌性从4°C转移到27°C培养箱中以开始产卵。
3. 当雌性开始产卵时（将它们移动到27°C后3-4天），使用细尖画笔去除任何卵，并为雌性准备Gené的器官（蜡腺）消融术。
   注意：Gené的器官从骷髅和头鳞之间的区域（口器的背基部）延伸，口器在腹体表面弯曲（平行于表面），一旦产卵，延伸的Gene器官就会覆盖卵子（图1）。在Gené的器官切除或排空蜡之前产下的卵子将具有蜡涂层，不适合注射，必须丢弃。
4. 要移除或清空Gen....

结果

本文描述了肩胛骨I.的成功胚胎注射方案。产卵的雌性保持在高湿度下，以避免部分打蜡的卵干燥。通过消融妊娠雌性的基因器官（蜡腺）来去除蜡层以注射蜱胚胎（图1A-E）。我们使用颈部较短的铝硅酸盐玻璃针（图2）。这种形状非常适合蜱卵注射，因为它比用于昆虫卵注射的长颈（锥形）针头可以更好地承受压力。?.......

讨论

这是第一个成功注射早期蜱虫胚胎的方案。已经实现了~4%-8%的存活率，这与其他成熟的^{昆虫模型中的}胚胎注射相当5。

由于这是最初的协议，预计该协议将进一步完善并专门针对单个蜱物种。特别是，注射时间因物种而异，取决于胚胎发生，尤其是细胞化的时间。初步数据表明， 肩胛骨I. 卵在产卵后的前24小时内不会经历快速核分裂，几天后发生细胞?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum silicate capillaries, with filament	Sutter instruments	AF100-64-10	Embryo injection
Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g	TCI-America	B0414	Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL
Filter paper	Whatman	1001-090	Post-injection care
Forceps	Thomas Scientific	300-101	Gene`s organ manipulation
Lab Wipes	Genesee Scientific	88-115
Microloader tips	Eppendorf	930001007	Loading the pulled needles
Micromanipulator	Sutter instruments	ROE-200	Embryo injection
Microscopic slides- plain, ground edges	Genesee Scientific	29-100	Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view
NaCl	Research Products International	S23020-500.0	Embryo treatment
Needle Puller	Sutter Instruments	P-1000
Permanent Double sided tape	Scotch	34-8716-3417-5	Embryo alignment
Petri plates	Genesee Scientific	32-107G	Post-injection care
Tegaderm/ Transparent film dressing	3M Healthcare	1628	Embryo alignment
Tungsten needles	Fine Science Tools	10130-10	Gene`s organ manipulation
Tungsten Wire	Amazon	B08DNT7ZK3	Gene`s organ manipulation
XenoWorks Digital Microinjector	Sutter instruments	MPC-200	Embryo injection