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摘要

在这里,我们描述了心肌梗死的实验模型,研究心脏重塑和功能的超声心动图程序,以及量化毛刺红染色和罗丹明染色切片纤维化和肥大的程序,以及用 Masson 三色染色的切片中的梗塞大小和扩张指数。

摘要

心血管疾病是西方国家最普遍的死亡原因,急性心肌梗死 (MI) 是最普遍的形式。本文描述了一种方案,用于研究半乳糖凝集素 3 (Gal-3) 在 MI 实验动物模型中心脏愈合和重塑的时间进化中的作用。

描述的程序包括雄性 C57BL/6J(对照)和 Gal-3 敲除 (KO) 小鼠具有永久性冠状动脉结扎的 MI 实验模型,用于研究 体内心脏重塑和收缩功能的超声心动图程序,间质心肌纤维化的组织学评估与毛刺红染色和罗丹明结合凝集素染色切片,用于通过横截面积 (MCSA) 研究肌细胞肥大, 以及通过平面测定法对用 Masson 三色和三苯基四唑氯化物染色的切片进行梗死面积和心脏重塑(疤痕变薄、隔膜厚度和扩张指数)的定量。 Gal-3 患有 MI 的 KO 小鼠显示心脏重塑中断,瘢痕变薄比率和扩张指数增加。在 MI 发作时,心肌功能和心脏重塑也受到严重影响。在 MI 后 4 周,梗死 Gal-3 KO 小鼠纤维化的自然演变也受到影响。

综上所述,MI 的实验模型是研究 Gal-3 基因缺失小鼠心脏修复和重塑时间演变的模型和其他动物模型。缺乏 Gal-3 会影响心脏修复的动力学,并破坏 MI 后心脏重塑和功能的演变。

引言

心肌梗塞 (MI) 是心血管疾病最普遍的形式。心肌梗死后,心肌发生一系列形态和功能变化,包括 MI 梗死区愈合、心室重塑 (VR) 和心肌功能障碍1。心肌梗死的愈合是一个动态且精心策划的过程,与深度炎症浸润相关,最终形成纤维化疤痕 2,3。小鼠 MI 的实验模型目前用于研究病理条件下的心脏重塑 4,5,并且了解精确的手术方案对于开发可重复且有效的诱导永久冠状动脉结扎的程序至关重要。需要这种方法来研究 MI 的愈合及其在左心室重塑 (LVR) 的时间演变和与 MI 相关的心功能障碍中的相关性。

半乳糖凝集素是一组凝集素,可识别细胞内配体、膜受体和细胞外糖蛋白中的特定碳水化合物。半乳糖凝集素 3 (Gal-3) 是该家族的一员,通过识别和交联细胞表面糖缀合物中的 N-聚糖和 O-聚糖发挥作用,并在免疫系统中广泛表达6。以前的研究调查了 Gal-3 在心血管疾病中作为炎症和纤维化调节剂的作用 7,8,9,10,11,12由于靶向愈合过程中炎症的调节因子具有高度相关性,因为炎症可以显着影响重塑的进化,因此我们旨在描述一种研究 MI 后心室重塑时间演变的方案,以及确定 Gal-3 基因突变如何改变 MI 愈合的时间演变并影响小鼠心脏重塑和功能的步骤和方法。

研究方案

注意:本协议中描述的所有实验均由布宜诺斯艾利斯大学动物护理和研究委员会 (CICUAL) 批准,与国家研究委员会 (US) 委员会一致,以更新实验动物护理和使用指南13。对于实验,使用体重为 30-35 g 的雄性、年龄匹配的 C57BL/6J 和 Gal-3 KO 小鼠(8-10 周龄),这允许更好的手术作。让动物 随意饮水和食物。 Gal-3 KO 小鼠在与对照 C57BL/6J 小鼠相同的生物资源设施中在 C57BL/6J 背景上繁殖。

1. 手术区域和器械

  1. 在开始手术之前,请确认呼吸机已插入电源并正常工作。确认有足够的麻醉溶液。通过计算要使用的动物数量,在手术当天准备溶液。
  2. 确认所有手术器械均已消毒,包括不锈钢剪刀、微型剪刀、大小针持针器、牵开器、超锋利、弯曲镊子、锯齿镊和组织镊子。用 70% 乙醇清洁工作区域。
  3. 确保有小棉球、牛膝草和纱布,以便立即烧灼任何潜在的出血。
  4. 保留准备好的 10-0 至 7-0 硅胶涂层编织丝缝合线,用于结扎左冠状动脉降支 (LDA),用于闭合胸腔的尼龙缝合线,以及用于闭合皮肤的亚麻线。

2. 麻醉和插管

  1. 称量小鼠以确定麻醉剂量。
  2. 将用聚苯乙烯泡沫塑料底座包围的加热垫预热至 40 °C。
  3. 肌肉注射含有氯胺酮 (65 mg/kg)、甲苯噻嗪 (13 mg/kg) 和乙酰丙嗪 (1.5 mg/kg) 的溶液 0.1 mL/10 g 体重的溶液麻醉小鼠。
  4. 一旦鼠标被麻醉,在开始外科手术之前,通过诱导轻微疼痛的刺激来检查麻醉深度,例如用手指按压脚。如果动物对刺激有反应,请调整麻醉剂深度。
  5. 将鼠标放在 背侧 decubitus 中,将其腿粘在加热垫上方的工作底座上,将其置于双目立体显微镜下。用一根线将上颌牙固定在工作底座上,过度伸展颈部。
  6. 然后,对于插管部分,通过颈部的最小切口露出气管环,并用连接到啮齿动物呼吸机的 20 G 静脉导管(潮气量:250 mL/中风)以 34-38 次循环/分钟的呼吸频率通过它,如前所述14
  7. 将动物置于侧卧位,在第四或第五肋间隙进行左侧开胸手术。在动物的皮肤上做一个切口;观察下面的肌肉,并小心地展开它们,将它们与胸壁分开,以清楚地看到肋间间隙。此时,确保动物已正确连接到呼吸机;然后,用额外的锋利镊子打一个孔,打开肋间隙。
    注意:LDA 应可沿上述肋间隙的游离左心室 (LV) 壁识别。
  8. 进行心包切除术,并通过对比冠状动脉与冠状静脉以及左耳廓下方的 LDA 分支来识别 LDA。然后,使用 8-0 执行 LDA 的结扎丝线距耳廓边缘 ~2 毫米。最后,使用 6-0 丝线分层闭合胸部 - 闭合肋骨,确保内部没有气胸(通过用呼吸机迫使肺部扩张来小心执行此作),并在闭合皮肤之前接近肌肉或缝合它们。
  9. 皮肤闭合后,慢慢断开小鼠与 腹侧呼吸机的连接,并在呼吸频率恢复时取出气管插管。让动物在安静的环境中从麻醉中恢复,最好在 27 °C 的稳定室温下恢复。
  10. 等待动物从麻醉中恢复过来,开始移动它们的四肢,并恢复正常的呼吸频率。然后,将它们安置在单独的笼子中,直到协议结束。
  11. 对对照或假手术动物执行相同的程序,但没有 LDA 的结扎。

3. 研究设计

  1. 为了测试 MI 后愈合和心室重塑的时间演变,将小鼠随机分为以下组:
    1. 为了研究 MI 进化 1 周后心室重塑的早期阶段,将小鼠分为以下组:1) C57 假手术(1 周);2) Gal-3 KO Sham (1 周);3) C57 MI (1 周);4) Gal-3 KO MI(1 周)。
    2. 为了研究 MI 4 周时心室重塑的晚期,将小鼠分配到以下组:5) C57 假手术(4 周);6) Gal-3 KO Sham (4 周);7) C57 MI (4 周);8) Gal-3 KO MI(4 周)。

4. 超声心动图

注意:对于小鼠超声心动图,必须使用超过 10 MHz 的线性换能器来正确观察壁直径和腔体大小。该程序可以在麻醉下使用 1.15 mL/kg 的腹膜内 (IP) avertin 或在清醒的动物中进行。然而,由于作引起的压力和焦虑,后者会导致 MI 小鼠的混淆结果。

  1. 要麻醉老鼠,请将其捡起,背对着手掌握住它,然后将其翻转过来以到达腹部表面。在该位置,以动物和皮下针头之间的 45° 角注射 IP 麻醉。
  2. 麻醉鼠标后,剃掉它的胸部,然后将鼠标放在预热的加热垫上,处于背卧位。要获得胸骨旁长轴和短轴视图,请将换能器移动 90°。获得正确的轴视图后,将光标置于肌水平,按 2-D M 模式 键捕获图像,并使用图像分析软件测量以下参数:
    1. 测量 LV 尺寸,包括壁厚 (LVWT)、收缩期 (S) 和舒张期 (D) 的 LV 面积,以及左心室舒张区 (LVDA) 和左心室收缩区 (LVSA),至少三次心跳。
    2. 此外,使用等式 (1)、等式 (2) 和方程 (3) 通过射血分数 (EF, %)、缩短分数 (SF, %) 和心脏质量(假设一个未校正的立方体)计算心室功能,如前所述15
      SF (%) = ([LVEDD - LVESD]/LVEDD) × 100 (1
      EF (%) = ([LVDA - LVSA]/LVDA) × 100 (2
      LV 质量 = 1.055 × ([IVST + LVEDD + PWT]3− [LVEDD]3) (3
      其中 LVEDD 是左心室舒张末期直径,LVESD 是左心室收缩末期直径,IVST 是脑室内厚度,PWT 是后壁厚度。

5. 组织学评估

  1. 在尸检过程中,通过从一侧到另一侧打开胸部并切开周围的所有结构,从动物身上取出心脏。使用薄纸轻轻按压,清洁腔内的血凝块。
  2. 在实验室精密秤上采集和称量心脏。在室温下将其浸入 10% 甲醛中至少 72 小时。使用刀片将心从顶端到基部手动切成 1 mm 厚的横向切片,并通过将切片嵌入石蜡中来处理切片。用切片机对 5 μm 厚的石蜡包埋切片进行连续切割。
  3. 将每个切片放在载玻片之间,并用苏木精和伊红 (H&E)、Masson 三色、罗丹明共轭凝集素染色切片或 Picrosirius 红15,16 染色。
    1. 通过使用合适的光显微镜,以 400 倍的倍率拍摄数字化图像,用于形态测量、纤维化和 MCSA 定量。确认显微镜已连接到数码相机,并连接到带有图像分析软件的计算机。对于每种形态测量分析,确保图像位于同一区域,每个切片至少有 10 个 400x 的高功率视野(隔膜、梗塞区和远程区域),并且视野不重叠。
      1. 要测量 MCSA,请注意心肌细胞的位置,并且只计数那些被横向切片并被至少三个附近毛细血管包围的肌细胞。
      2. 在 Picrosirius 红色染色切片中,识别疤痕和隔膜区域,并对两个区域的间质胶原蛋白进行成像。将图像上传到分析软件上,然后打开阈值选项卡以突出显示所有阳性和阴性胶原蛋白区域要获取数据,请按测量选项卡,然后保存结果。对于每个区域胶原蛋白百分比的计算,使用方程 (4),然后加上胶原蛋白阳性区域并将它们除以总组织,包括胶原蛋白阳性区域,如其他地方所述15,16
        胶原蛋白 (%) = Picrosirius 红面积/总组织面积 (4
      3. 从石蜡包埋样品的罗丹明偶联凝集素染色切片获得的数字化图像中定量 MCSA。为了获得正确的图像,请使用图像分析软件追踪细胞膜周围肌细胞的红色轮廓。选择 area 选项卡,跟踪轮廓,然后按 measure 选项卡功能。最后,保存单元格区域16 的结果。

6. 定量测定梗死面积和平面测定以评估心脏重塑

  1. 使用平面测量法测量心肌梗死面积、壁厚以及心内膜和心外膜周长,这些图像来自光学显微镜 (4x) 和适当软件获得的 Masson 三色染色切片的组织学图像。
    1. 为了量化梗死面积,确定梗死区(蓝色)和远端区(红色)。追踪并测量心内膜和心外膜侧梗死区和远端区的总长度。计算心内膜和心外膜描记的平均值占总 LV 周长的百分比17
    2. 同样,测量心脏中段的瘢痕厚度(5 次等距测量的平均值)和间隔厚度(3 次等距测量的平均值),并使用这些测量值来确定瘢痕厚度比(公式 [5])和扩张指数(公式 [6]18)。
      注意:所有值都可以记录在电子表格中。
      疤痕厚度比 = 疤痕厚度/隔膜厚度 (5
      扩张指数 = (左心室腔面积/左心室总面积) × (隔膜厚度/瘢痕厚度) (6
      注意:由于重塑可能会改变扩张,导致低估或高估梗塞大小,因此可能需要一些时间进行试点实验以测量 24 小时梗塞大小,然后进行安乐死。在这种情况下,使用用于 MI 程序的相同 IP 麻醉溶液麻醉动物。
  2. 将动物置于背侧 decubitus 中,并如前所述插管。麻醉动物后,做一个深的对角线切口,从剑突到腋窝凹陷到达皮肤、肌肉和肋骨。
  3. 隔离主动脉弓,在升主动脉上开一个小孔,并引入导管,用 Evan 蓝灌注心脏。然后,手动去除动物身上染色的心脏,并用锋利的刀片从顶端切到底部。将心脏切片置于等渗磷酸盐缓冲液 (pH 7.4) 中的 1% 三苯基四唑氯化物 (TTC) 中,并在 37 °C 下孵育 30 分钟 4 以确认动物在梗塞大小方面具有可比性。

结果

心肌梗死后生存和尸检
在 4 周的随访中,发现 17% (4/23) 的 C57 小鼠与 40% (8/20) 的 Gal-3 KO 小鼠死亡。进行了尸检;死亡的 Gal-3 KO 小鼠显示出比 C57 小鼠更大的心脏(图 1),并且 38% 的 C57 小鼠与 32% 的 Gal-3 KO 小鼠相比具有与心脏破裂直接相关的肉眼可见的胸部凝块。后者表明死因与心脏破裂无关。在方案结束时...

讨论

通过永久冠状动脉结扎的 MI 实验模型用于研究心脏修复和重塑的各种病理生理机制 5,14,17。本文总结了该实验室目前用于研究心脏修复的时间演变及其对 MI 后心室重塑影响的不同方法14,17。迄今为止,主要研究了两种缺血性心脏病模型:永久性冠状动脉结扎...

披露声明

作者没有需要声明的利益冲突。

致谢

作者非常感谢 Ana Chiaro 的技术援助。这项工作得到了阿根廷科学技术促进局(PICT 2014-2320、2019-02987 和 PICT 2018-03267 至 VM)和布宜诺斯艾利斯大学(UBACyT 2018-382 20020170100619BA 至 GEG)的资助。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
8-0 silk suture Ethicon
C57BL/6J miceDepartment of Bioresources of the Faculty of Veterinary of the University of Buenos Aires, Argentina
Forceps
Hardvard 386 respiratorHardvard company
Heating padmaintain animal's temperature during surgery
Image Pro-Plus 6.0Media CyberneticsImage Analysis Software
Ketamine Holiday
Masson TrichromeBIOPUR
Picrosirius redBIOPUR
Retractors
 Rodent Ventilator Model 683 Harvard ApparatusMechanical ventilator
Scissors 
Stereoscopic magnifying glassArcano
Vivid 7 machine (General Electric Medical Systems, Horten, Norway)General ElectricAny tracking software can be utilized with this protocol
WGA no. RL-1022, Vector Laboratories, BurlingameVector Laboratories
XylazinePro-Ser

参考文献

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