体内 小鼠下颌下腺血管通透性检测

摘要

在本协议中，通过在双光子激光扫描显微镜下将不同分子加权荧光示踪剂注射到 体内 测试动物模型的角静脉中来评估下颌下腺（SMG）的内皮屏障功能。

摘要

唾液在口腔和整体健康中起着重要作用。血管完整的内皮屏障功能使唾液分泌，而内皮屏障功能障碍与许多唾液腺分泌疾病有关。本协议描述了一种 体内 细胞旁通透性检测方法，以评估小鼠下颌下腺（SMG）中内皮紧密连接（TJ）的功能。首先，将具有不同分子量（4 kDa，40 kDa或70 kDa）的荧光标记葡聚糖注射到小鼠的角静脉中。之后，在双光子激光扫描显微镜下解剖单侧SMG并将其固定在定制的支架中，然后捕获血管，腺泡和导管的图像。利用该方法，监测不同大小示踪剂从血管到腺泡基底侧甚至穿过腺泡上皮进入导管的实时动态泄漏，以评估生理或病理生理条件下内皮屏障功能的改变。

引言

各种唾液腺产生唾液，唾液主要作为抵御感染的第一道防线并帮助消化，从而在口腔和^{整体健康中}发挥重要作用1。血液供应对唾液腺分泌至关重要，因为它不断提供形成主要唾液的水、电解质和分子。由紧密连接（TJ）复合物调节的内皮屏障功能严格而微妙地限制了毛细血管的渗透，毛细血管对水，溶质，蛋白质甚至从循环血管移动到唾液腺组织的细胞都具有高度^{渗透性2，3}。我们之前发现，响应胆碱能刺激而打开内皮TJs有助于唾液分泌，而内皮屏障功能的损害与干燥综合征4中下颌下腺（SMG）的分泌不足和淋巴细胞浸润相互^关联。这些数据表明，对于多种唾液腺疾病，内皮屏障功能的贡献需要引起足够的重视。

双光子激光扫描显微镜是观察体内完整组织中细胞动力学的有力工具。该技术的优点之一是，当标本被近红外激发时，近红外光（NIR）比可见光或紫外光具有更深的组织穿透力，并且在适当的条件下不会对组织造成明显的光损伤^5，6。事实上，唾液腺是一种非常均匀和浅表的组织，其中表面腺泡细胞距离腺^体表面仅约 30 μm7^，

研究方案

所有实验程序均经北京大学医学部动物研究伦理委员会批准，并符合《实验动物护理和使用指南》（NIH出版物第85-23号，1996年修订）。8-10周年龄组的雄性野生型（WT）小鼠用于本研究。实验动物经过精心治疗，以尽量减少它们的疼痛和不适。

1. 动物程序

1. 准备和管理麻醉剂和示踪剂。
   1. 在整个研究过程中保持无菌条件，并通过高压灭菌对器械进行灭菌。将小鼠分成两组。
      注意：对照组未治疗，另一组单侧SMG导管结扎1天作为实验组。分组时，需要选择体重和年龄相似的小鼠，以减少体重和年龄对血管通透性的影响。
   2. 选择合适的示踪剂，例如异硫氰酸荧光素（FITC）标记的葡聚糖（分子量：4 kDa;FD4）和罗丹明B标记的葡聚糖（分子量：70kDa;RD70）（参见 材料表）具有不同的激发/发射光谱，以最大限度地减少渗透性测定中荧光信号之间的干扰（分别使用FITC或罗丹明B滤光片）。
      注意：FD4和RD70的激发波长分别为488nm和594nm，所选发射波长分别为511-564nm和617-669nm。
   3. 将示踪剂稀释在无菌磷酸盐缓冲盐水（1x PBS）中，放入100mg / mL储备液中，并将等分试样避光储存在-20°C。
      注意：分子量如4 kDa的葡聚糖即使没有病理状况，也会从小鼠SMG的血液中迅速泄漏^1....

结果

按照协议，将单侧SMG连接到定制的支架上，并且腺体尽可能远离小鼠身体，以防止呼吸引起运动伪影。在显微镜下观察到血管中红细胞（黑点）的快速流动。在发现人工晶状体下的组织区域后，必须切换到操作显微镜软件。在对照组中，两种示踪剂都存在于小鼠SMG的血管中。特别是，由于其分子量小，FD4能够从血管泄漏到腺泡和导管的基底侧，从而清楚地描绘出腺泡和导管的形状（如

讨论

维持和调节内皮屏障功能对于血管稳态至关重要。内皮细胞及其细胞间连接在维持和控制血管完整性方面起着关键作用¹²。血流、生长因子和炎症因子的剪切力可引起血管通透性的变化，从而参与高血压、糖尿病和自身免疫性疾病等全身性疾病的发生和发展¹³，^14，15。唾液腺的血管分布和血流是所有器官和组?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-photon microscope (TCS-SP8 DIVE)	Leica, Germany
4 kDa FITC-labeled dextran	Sigma Aldrich	46944
70 kDa rhodamine B-labeled dextran	Sigma Aldrich	R9379
Blunt tissue separation nickel	Bejinghuabo Company	NZW28
Depilatory cream	Veet
Disposable sterile syringe	Zhiyu Company		1 mL
Image J software	National Institutes of Health
Insulin syringe	Becton, Dickinson and Company	0253316	1 mL
Leica Application Suite X software	Leica Microsystems
Microtubes	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL
Phosphate buffered saline 1x	Servicebio	G4207-500
Tissue scissors	Bejinghuabo Company	M286-05
Tribromoethanol	JITIAN Bio	JT0781