通过产 卵电 穿孔解剖听觉回路中脆性X智力迟钝蛋白的细胞自主功能

摘要

利用 卵 电穿孔，我们设计了一种选择性转染鸡胚胎中听觉内耳和耳蜗核的方法，以实现在电路组装的离散期间脆性X智力迟钝蛋白的细胞组特异性敲低。

摘要

脆性X染色体智力低下蛋白（FMRP）是一种调节局部蛋白质翻译的mRNA结合蛋白。FMRP丧失或功能障碍导致脆性X综合征（FXS）的神经元和突触活动异常，其特征是智力障碍，感觉异常和社会沟通问题。FMRP功能和FXS发病机制的研究主要在转基因动物中使用 Fmr1 （编码FMRP的基因）敲除进行。在这里，我们 报告了一种体内 方法，该方法用于使用鸡胚胎确定FMRP在电路组装和突触形成期间的细胞自主功能。该方法采用含有 Fmr1 小发夹RNA（shRNA）和EGFP报告基因的药物诱导载体系统的阶段，位点和方向特异性电穿孔。通过这种方法，我们在听觉神经节（AG）及其脑干靶标之一大细胞核（NM）中实现了选择性FMRP敲低，从而在AG-NM电路中提供了组件特异性操作。此外，转染的镶嵌模式允许动物内对照和邻近神经元/纤维比较，以提高数据分析的可靠性和灵敏度。诱导载体系统提供基因编辑开始的时间控制，以最大限度地减少累积的发育影响。这些策略的组合为剖析FMRP在突触和电路发育中的细胞自主功能提供了一种创新工具。

引言

脆性 X 综合征 （FXS） 是一种以智力障碍、感觉异常和自闭症行为为特征的神经发育障碍。在大多数情况下，FXS是由从早期^{胚胎阶段开始}的脆性X智力迟钝蛋白（FMRP;由Fmr1基因编码）的全球损失引起的1。FMRP是一种RNA结合蛋白，通常在大脑中的大多数神经元和神经胶质细胞以及感觉器官中表达²，^3，4。在哺乳动物的大脑中，FMRP可能与数百种编码对各种神经活动很重要的蛋白质的mRNA有关⁵。对常规Fmr1基因敲除动物的研究表明，FMRP表达对突触^{神经传递的}组装和可塑性尤为重要6。一些条件和马赛克敲除模型进一步证明，FMRP作用和信号在几个发育事件中因大脑区域，细胞类型和突触部位而异，包括轴突投影，树突状图案和突触可^塑性7，⁸，⁹，^10，11，^12，13，14.通过在脑切片或培养的神经元中细胞内递送抑制性FMRP抗体或FMRP本身来研究FMRP在调节突触传递方面的急性功能¹⁵，¹⁶，^17，18。然而，这些方法不能在开发过程中跟踪FMRP误表达诱导的后果。因此，非常需要开发体内方法来研究FMRP的细胞自主功能，并有望帮助确定FXS患者中报告的异常是相关神经元和回路中FMRP丢失的直接后果，还是发育过程中网络范围变化的继发性后果¹⁹。

鸡胚胎的听觉脑干为电路和突触发育中FMRP调节的深入功能分析提供了一个独特的优势模型。易于获得胚胎鸡脑和成熟的用于遗传操作的 卵 电穿孔技术极大地促进了我们对早期胚胎阶段大脑发育的理解。在最近发表的一项研究中，该技术与先进的分子工具相结合，可以对FMRP错误表达进行时间控制^20，21。在这里，该方法被推进到分别诱导突触前和突触后神经元的选择性操作。这种方法是在听觉脑干回路中开发的。声音信号由听觉内耳中的毛细胞检测到，然后传递到听神经节（AG;在哺乳动物中也称为螺旋神经节）。AG中的双极神经元通过其外周过程支配毛细胞，进而将中枢投影（听觉神经）发送到脑干，在那里它们终止于两个初级耳蜗核，即大细胞核（NM）和角核（NA）。NM中的神经元在结构和功能上与哺乳动物前腹侧耳蜗核的球形灌丛细胞相当。在NM内，听觉神经纤维（ANF） 突触通过 Hold终端²²的大端球在NM神经元的躯体上突触。在发育过程中，NM 神经元起源于后脑²³ 中的菱形 5 和 6 （r5/6），而 AG 神经元源自耳囊²⁴ 中的神经母细胞。在这里，我们分别描述了在突触前AG神经元和突触后NM神经元中选择性敲低FMRP表达的过程。

研究方案

鸡蛋和鸡胚胎按照暨南大学动物护理和使用委员会批准的动物规程进行谨慎和尊重的处理。

1. 卵子和质粒制备

1. 鸡蛋准备
   1. 从华南农业大学获得新鲜受精鸡蛋（Gallus gallus），并在孵化前储存在16°C。为了获得最佳的活力，请在到达后一周内设置所有种蛋进行孵化。
   2. 将鸡蛋水平放置并在38°C下孵育46-48小时，直到汉堡和汉密尔顿（HH）阶段12²⁵ 进行神经管转染，或54-56小时直到HH13进行耳囊转染。由于卵子的动物极比植物极轻，因此水平放置将胚胎放置在卵的顶部以便于操作。在此步骤和所有后续步骤中，请小心保持鸡蛋水平。
   3. 当使用手电筒从鸡蛋底部投射光线时，胚胎的位置在蛋壳上显示为黑暗区域。在所需的HH阶段，使用这种手电筒方法用铅笔标记胚胎在蛋壳上的位置。
   4. 用含有75%乙醇的纱布擦拭鸡蛋。用剪刀尖端在鸡蛋的尖端钻一个孔，然后用 2 G 针头注射器取出 18 mL 白蛋白。确保孔仅足够大以允许针头插入。用纱布擦去任何泄漏的白蛋白，并用透明胶带密封孔。
   5. 为了尽量减少裂缝并防止在开窗过程中掉落的贝壳碎屑，请用透明胶带覆盖鸡蛋的顶部，以铅笔标记的黑暗区域为中心。
2. 质粒DNA提取
   1. 如前所述^，使用基于转座子的Tet-on系统克隆鸡Fmr1 shRNA。该系统包含三种质粒:pCAGGS-T2TP、pT2K-CAGGS-rtTA-M2和pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA，提供药物诱导载体系统，通过该系统，Fmr1 shRNA和EGFP的表达在转染后沉默，并可通过强力霉素（Dox）诱导开启。
      注意:这些质粒目前在存储库中不可用。作者同意根据合理要求提供质粒。
   2. 根据制造商的说明使用无内毒素制备试剂盒提取质粒DNA，并通过加入1/15体积的7.5 M乙酸钠和1体积的100%异丙醇沉淀。
   3. 在-20°C下沉淀质粒过夜，并以13，000× g 离心10分钟。用试剂盒中提供的Tris-EDTA缓冲液溶解沉淀至4-5μg/μL的终浓度。 质粒可在-20°C下储存12个月，而不会降低转染效率。
   4. 在电穿孔当天，使用移液器吸头在无菌离心管中彻底混合 2 μL 每个质粒。所得的 6 μL 体积的质粒混合物足以电穿孔三打卵。为了在电穿孔过程中帮助可视化质粒，每 6 μL DNA 混合物²⁶ 加入 1 μL 0.1% 快速绿（在无菌 ddH₂O 中制备），使质粒混合物变成蓝色。

2. 卵内 电穿孔

1. 卵子窗口化和胚胎鉴定
   1. 在电穿孔当天，从孵化器中取出鸡蛋，一次一打鸡蛋。将种蛋从孵化器中取出超过 1 小时会引入发育变化并降低活力。
   2. 用含有75%乙醇的纱布擦拭所有手术工具。
   3. 将每个鸡蛋放入定制的泡沫架中。用75%乙醇擦拭胶带覆盖的区域，并使用一把小剪刀在铅笔标记的圆周周围切一个窗口（1-2厘米²）（图1A）。切割时，将剪刀平放，以免损坏下面的胚胎。
   4. 将有窗的鸡蛋放在带有10倍目镜和2倍变焦的立体显微镜下，并识别胚胎。调整光源的角度和亮度以获得更好的可视化效果。
      注意:在这个阶段，可视化胚胎和识别神经管需要实践和经验。
      1. 对于初学者，请使用以下可选的墨水注射来促进胚胎识别。在0.01M磷酸盐缓冲盐水（PBS）中制备10%印度墨水溶液，并提前高压灭菌。用墨水溶液填充 1 mL 注射器，然后安装 27G 针头。用镊子将针头弯曲成45°角。
      2. 在显微镜下，小心地从opaca区域的边缘戳出，然后将针头插入胚胎下方。注入 ~50 μL 墨水，其将扩散到透明区域下方以进行胚胎可视化。墨水将形成深色背景，以清晰地显示胚胎。
         注意:在插入和注射之前从注射器中排出空气。熟练地进行可视化时，请避免墨水注入步骤，因为它会降低存活率。
2. 神经管注射和电穿孔
   注意:此过程在HH12下进行，用于转染脑干中的NM神经元。
   1. 使用移液器拉拔器将玻璃毛细管（直径~1 mm，长100 mm）拉入移液器中。在解剖显微镜下，用镊子小心地将毛细管针的尖端打开直径至10-20μm。将移液器（通常一次5-10个）存放在储物盒中直至使用。
   2. 通过移液器末端的橡胶管施加负压，用 0.5-1 μL 质粒混合物填充毛细管移液器。这可以通过注射器或气泵来实现。
   3. 将卵子放在显微镜下，使胚胎垂直定向，尾巴靠近您（或水平方向使用三轴操纵器注射毛细管移液器）。用一只手或三轴机械手握住毛细管移液器，并以尾对头方向将移液器的尖端驱动到 r5/6。
      注意:最前的后脑区域是r1，随后沿着神经管的每个凸起都是一个单独的菱形。R5/6与耳囊处于同一前后水平，耳囊是一种易于识别的杯状结构（图1B-C）。
   4. 轻轻地将尖端穿过卵黄膜并插入背神经管，然后稍微撤回移液器，使尖端在神经管腔内。通过施加气压注入质粒混合物，直到有色质粒完全扩散到 r5/6 中并延伸到 r3 和 r4 中。
      注意:没有必要在玻璃膜上制作一个用于注射的槽。
   5. 检查注射是否成功，这是当蓝色质粒溶液快速扩散到神经管而不泄漏时实现的（图1B-C）。当泄漏发生时，蓝色会迅速褪色。
   6. 注射后，立即在神经管的两侧放置一个铂双极电极（图1D）。使用电穿孔器提供两个持续时间为 12 V 和 50 ms 的脉冲。观察双极电极末端的气泡，负极端的气泡更多。
   7. 检查电穿孔是否成功，这是在有色质粒混合物进入电极正极附近的神经管组织时实现的。电穿孔后，小心地取出双极电极。
   8. 用一块透明薄膜覆盖蛋壳上的窗户，该薄膜预先切成 2 个正方形并喷洒 75% 乙醇。将鸡蛋放回孵化器中。
   9. 在进行下一个鸡蛋之前，通过在盐水中提供 10-20 V 和 50 ms 持续时间的脉冲来清洁双极电极。
3. 耳囊注射和电穿孔
   注意:此过程在HH13进行，用于转染内耳中的毛细胞和AG神经元。
   1. 在HH13（~胚胎第2.5天），胚胎已经转动，因此头部的右侧朝上。在显微镜下，将卵子放在垂直的位置，使胚胎垂直，尾巴靠近您。握住毛细管移液管，沿背外侧方向轻轻戳右耳囊（图2A）。
      注意:在这个阶段，耳囊在身体顶部显示为一个小的圆形结构，与r5 / 6的前后水平相同。
   2. 用气压注入质粒混合物，直到耳囊充满蓝色溶液²⁷。检查注射是否成功，这是当蓝色质粒混合物被限制在耳囊内并且不泄漏时实现的。
   3. 注射后，立即将双极电极放在耳囊上，如图 2B所示。将阳性和阴侧分别放置在耳囊的前方和后方。使用电穿孔器提供两个持续时间为 12 V 和 50 ms 的脉冲。
   4. 检查电穿孔是否成功，这是当蓝色质粒混合物进入电极正极附近的耳囊组织时实现的。电穿孔后，小心地取出双极电极。用透明薄膜盖住蛋壳上的窗口，然后将鸡蛋放回孵化器。

3. 施用 Dox 以启动和维持质粒转录

1. Dox溶液的制备
   1. 在化学罩下测量 100 mg Dox 粉末，并将其溶解在 100 mL 无菌 PBS 中，制成 1 mg/mL 的工作溶液。用0.22μm过滤器过滤溶液，并将1mL等分试样储存在-20°C。 避光^20，28。
2. Dox 的管理
   1. 对于全强度基因编辑，在所需年龄前24小时，在冰上解冻Dox等分试样。使用穿透透明薄膜的注射器将 50 μL Dox 直接滴在鸡蛋的脉络膜尿囊膜上。注射后用透明薄膜或胶带密封针孔。
   2. 为了保持敲低效果，每隔一天施用Dox，直到在所需的发育阶段收获组织。

4. 组织解剖和切片

1. 脑干
   1. 对于胚胎阶段 3 （E3） 和 E6 的胚胎，打开蛋壳并用剪刀剪断相关的膜。用勺子将胚胎取出，并将其浸入0.1M磷酸盐缓冲液中的4%多聚甲醛（PFA）中。
   2. 对于E9胚胎，打开蛋壳，用剪刀将胚胎斩首，然后将头部转移到装有PBS的硅底板上。将头部向下穿过眼眶，将头骨顶部切开。小心地将镊子从两侧放在大脑下方，并用镊子的肩膀将整个大脑从颅骨抬起。将大脑浸入4%的PFA中。
   3. 对于E15和E19胚胎，打开蛋壳，用剪刀斩首胚胎，然后将头部放在充满PBS的硅底板上。切开头顶的皮肤以露出头骨。
   4. 用剃刀垂直切开颅骨，将前脑和尾脑分开。将尾块浸入PBS中，去除头骨顶部，然后将大脑从头骨上取下。
   5. 将大脑向下固定通过视叶并将小脑和脑干分开。注意不要损坏位于小脑正下方的听觉脑干。从脑干中去除尽可能多的硬脑膜，然后将其浸入4%PFA中。
   6. 将胚胎和脑组织保持在4°C的4%PFA中过夜，除了E19脑干，应在相同条件下保持24小时。
   7. 固定后，在含有30%蔗糖的PBS中脱水组织直至沉淀，这通常需要1-3天，具体取决于年龄。
   8. 使用滑动切片机在冠状平面处以30μm处切片脑干（E15和E19）。在PBS中收集切片并在免疫染色前储存在4°C。
   9. 对于E3和E6胚胎和E9脑干，横向切片50μm。收集PBS中的切片并储存在4°C。 免疫染色前将切片安装在明胶包被的显微镜载玻片上。收集这些年龄段的较厚切片有助于组织处理。
2. 听道
   1. 从E9、E15和E19胚胎中取出脑干后，嵌入颞骨的听觉管很容易识别，位于颅骨下方，颞骨很容易与周围的头骨分离。对于E9胚胎，将整个颞骨固定在4%PFA中。对于年龄较大的胚胎，去除颞骨的骨结构以隔离听觉管并将听觉管固定在 4% PFA 中。
   2. 在组织包埋之前，将所有颞骨和听管保持在4°C的4%PFA中过夜。
   3. 按照描述进行组织包埋。准备包埋溶液如下:将10%明胶（来自牛皮）浸泡在冷水中，直到明胶颗粒膨胀并沉降（约30分钟）。将混合物加热至~50°C以溶解明胶，并在明胶溶液中加入20%蔗糖并搅拌溶解。将明胶 - 蔗糖溶液在4°C下储存长达一个月。
   4. 使用时，在37°C下加热明胶 - 蔗糖溶液。 将颞骨/听管浸泡在37°C的96孔板上的温明胶 - 蔗糖溶液中，直到它们沉降，通常为30-60分钟。
   5. 用透明薄膜条排列 12 孔板孔的底部。加入一层温热的明胶-蔗糖溶液，等到它凝固。将颞骨/听管转移到每个孔中。
   6. 用第二层温热的明胶 - 蔗糖溶液植入组织。调整组织的位置，使其位于凝胶的中心，并且听觉导管水平定向。小心地将板移动到4°C冰箱中，等待凝胶变硬。
   7. 拉动透明膜条将凝胶组织块移出孔。将多余的凝胶修剪成方形块，并切开块的一角以确定方向。用箔纸包裹明胶块，在干冰上冷冻，然后在-80°C下储存直至切片。
   8. 用低温恒温器沿听道经度在20μm处切片块。将切片直接安装在涂有明胶的显微镜载玻片上。免疫染色前将载玻片储存在-80°C。
   9. 在免疫染色之前，将载玻片浸入预热的PBS（45°C）中5分钟以溶解明胶，然后用室温PBS洗涤载玻片3次以除去残留的明胶。

5. 免疫染色和显微镜成像

注意:根据切片是安装在载玻片上还是在PBS中自由浮动，执行两种类型的免疫染色。

1. 载玻片上的免疫染色
   1. 用PBS清洗载玻片3次，每次10分钟。用油笔在包含切片的区域周围画圈，以防止染色过程中液体泄漏。用含有PBS中5%正常山羊血清的封闭溶液覆盖切片，并在室温下孵育30分钟。
   2. 在含有0.3%TritonX-100和5%正常山羊血清的PBS中稀释一抗（使用的最终浓度请参阅材料表）。取出封闭溶液，然后用一抗溶液覆盖切片。将载玻片在4°C下在底部装有一层蒸馏水的盒子中孵育过夜。
   3. 用PBS冲洗载玻片3次10分钟。在载玻片上应用在含有 0.3% TritonX-100 的 PBS 中以 1:500 稀释的荧光二抗。将载玻片在室温下孵育4小时，避光。
   4. 用PBS清洗载玻片3次。将两滴安装剂轻轻滴在载玻片上，并用盖玻片覆盖这些部分。注意不要在盖玻片和载玻片之间产生气泡。
2. 全安装胚胎和自由漂浮切片的免疫染色
   1. 用PBS 3x在孔板中洗涤胚胎/切片10分钟。在离心管中稀释含有 0.3% TritonX-100 和 5% 正常山羊血清的 PBS 中的一抗。将每个胚胎/切片转移到带有玻璃钩的管中，并在4°C下以60rpm在振荡器上孵育过夜。
   2. 用PBS在孔板中洗涤胚胎/切片3次，每次10分钟。将每个胚胎/切片转移到装有荧光二抗溶液的深色离心管中，并在室温下在摇床上孵育4小时。
   3. 在孔板中用PBS清洗胚胎/切片3次。使用刷子将切片安装在含有PBS的15厘米培养皿中的明胶涂层显微镜载玻片上。载玻片稍微干燥（~5分钟）后，涂上两滴封片剂并放置盖玻片。注意不要在盖玻片和载玻片之间产生气泡。将整个封片组织保存在PBS中进行成像。
3. 成像
   1. 在带有含有碳粉的硅底的培养皿中对PBS中的整个安装组织进行成像，该培养皿提供黑色背景。使用商业图像处理奥林巴斯软件包捕获和处理图像，如前所述²⁹.
   2. 如前所述，用共聚焦显微镜对载玻片上的切片进行成像²⁰.使用10倍、20倍和63倍物镜在单个焦平面上对切片进行成像。使用相同的参数捕获来自同一动物的所有图像。注意调整激光电平和成像采集设置，以避免信号饱和。
   3. 使用斐济软件进行图像处理。为了说明，使用专业的图像编辑软件调整图像亮度、对比度和伽玛。

结果

通过在不同部位和不同发育阶段进行 卵 电穿孔，我们在听觉外周或听觉脑干中实现了选择性FMRP敲低。

新墨西哥州的FMRP敲低
如前所述，设计针对鸡Fmr1的小发夹RNA（shRNA）并将其克隆到Tet-On载体系统中²⁰。 卵内电穿孔的设置如图1A所示。将带有快速绿色着色的质粒DNA在HH12下以r5 / r6水平注射到神经管中...

讨论

为了确定FMRP的细胞自主功能，需要操纵其在单个细胞组或细胞类型中的表达。由于FMRP的主要功能之一是调节突触形成和可塑性，因此选择性地操纵某个回路的每个突触组件是充分了解突触通信中FMRP机制的先决条件。在鸡胚胎的卵电穿孔中，我们展示了一种在突触前AG神经元或突触后NM神经元中靶向AG-NM回路中FMRP表达的方法。为了实现这一目标，为电穿孔选择合适的...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Egg incubation
16 °C refrigerator	MAGAT		Used for fertilized egg storage.
Egg incubator	SHANGHAI BOXUN	GZX-9240MBE
Fertilized eggs	Farm of South China Agricultural University		Eggs must be used in one week for optimal viability.
Plasmid preparation
Centrifuge	Sigma	10016
Fast green	Solarbio	G1661	Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.
Plasmid Maxi-prep kit	QIAGEN	12162	Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit
Sodium Acetate	Sigma-Aldrich	S2889	Make 7.5M working solution in nuclase-free water.
Electroporation and Doxycycline Administration
Electroporator	BTX	ECM399
1 mL / 5 mL Syringe	GUANGZHOU KANGFULAI
Dissecting microscope	CNOPTEC	SZM-42
Doxcycline	Sigma-Aldrich	D9891	Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C.
Glass capillary	BEIBOBOMEI	RD0910	0.9-1.1 mm*100 mm
Laboratory parafilm	PARAFILM	PM996	transparent film
Pipette puller	CHENGDU INSTRUMENT FACTORY	WD-2	Pulling condition: 500 °C for 15 s
Platinum elctrodes	Home made		0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Rubber tube	Sigma-Aldrich	A5177
Tissue Dissection and Fixation
Forceps	RWD	F11020-11	Tip size: 0.05*0.01 mm
Other surgery tools	RWD
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week.
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	DOW	01673921	For black background plates, food-grade carbon powder is applied.
Sectioning
Cryostat	LEICA	CM1850
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391	From bovine skin.
Sliding microtome	LEICA	SM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse	Abcam	ab150113	1:500 dilution, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit	Abcam	ab150078	1:500 dilution, RRID: AB_2722519
DAPI	Abcam	ab285390	1: 1000 dilution
Fluoromount-G mounting medium	Southern Biotech	Sb-0100-01
FMRP antibody	Y. Wang, Florida State University	#8263	1:1000 dilution, RRID: AB_2861242
Islet-1 antibody	DSHB	39.3F7	1:100 dilution, RRID: AB_1157901
Netwell plate	Corning	3478
Neurofilament antibody	Sigma-Aldrich	N4142	1:1000 dilution, RRID: AB_477272
Parvalbumin antibody	Sigma-Aldrich	P3088	1:10000 dilution, RRID: AB_477329
SNAP25 antibody	Abcam	ab66066	1:1000 dilution, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshop	ADOBE		image editing software
Confocal microscope	LEICA	SP8
Fluorescent stereomicroscope	OLYMPUS	MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0	OlYMPUS		commercial image processing software package