从原代细胞和培养细胞制备细胞质和核长RNA

摘要

本协议提供了一种高效灵活的方法，使用培养的细胞从核和细胞质级分中分离RNA，然后使用qPCR进行验证。这有效地替代了其他RNA制备试剂盒。

摘要

多年来，细胞内成分的分离一直是细胞生物学的关键工具，并且已经能够提供有关其位置如何影响其功能的有用见解。特别是，核和细胞质RNA的分离在癌细胞和寻找药物新靶点的背景下变得很重要。当许多所需材料可以在典型的实验室环境中找到时，购买用于核细胞质RNA提取的试剂盒可能很昂贵。使用本方法可以替代更昂贵的试剂盒或其他耗时的过程，只需自制的裂解缓冲液、台式离心机和RNA分离纯化柱即可分离核和细胞质RNA。裂解缓冲液用于温和地裂解细胞的外膜，而不会影响核包膜的完整性，从而释放其细胞内成分。然后，可以通过简单的离心步骤分离细胞核，因为它们具有比裂解溶液更高的密度。离心用于根据其密度差异分离这些区域，以分离细胞核中的亚细胞元素和细胞质中的亚细胞元素。离心分离出不同组分后，使用RNA净化试剂盒纯化RNA含量，并进行qPCR以验证分离质量，通过不同级分中核和细胞质RNA的量进行定量。实现了统计学上显着的分离水平，说明了该方案的有效性。此外，该系统可以适用于分离不同类型的RNA（总RNA，小RNA等），从而可以有针对性地研究细胞质 - 细胞核相互作用，并有助于了解驻留在细胞核和细胞质中的RNA功能的差异。

引言

细胞分离成亚细胞成分允许分离和研究定义的生化结构域，并有助于确定特定细胞过程的定位以及这可能如何影响其功能¹。从不同的细胞内位置分离RNA可以提高转录水平事件以及细胞核和细胞质之间其他相互作用的遗传和生化分析的准确性，这是当前方案²的主要目的。该协议的开发旨在确保细胞质和核RNA的分离，以确定它们在核输出中各自的作用，并了解细胞核和细胞质中RNA的亚细胞定位如何影响其在细胞过程中的功能。使用来自典型实验室环境的材料，可以在不损害结果质量的情况下比以前建立的方案更有效、更便宜地实现细胞核和细胞质分离³。

此外，可以通过分离这些区域直接研究细胞质和细胞核之间的分子交换。更具体地说，了解转录组对于理解发育和疾病至关重要。然而，RNA在任何给定时间可能处于不同的成熟水平，并且可能使下游分析复杂化。该协议允许从核和细胞质亚细胞组分中分离RNA的能力，这可以帮助RNA的研究，并允许更好地了解感兴趣的特定RNA，例如非编码RNA的定位或细胞核内剪接连接的分析。

由于所使用的RNA纯化柱的大小选择性，该协议已针对分离细胞质和核长RNA（包括mRNA，rRNA和长非编码RNA（lncRNA）进行了优化，可以对其进行修饰以分离其他感兴趣的RNA。以前，长RNA的功能，如mRNA和lncRNA，高度依赖于它们各自^{在细胞内的}定位4^，5。因此，从细胞核到亚细胞结构域的输出研究变得更加有针对性的是了解输出RNA或其他细胞成分对细胞的作用。lncRNA就是一个典型的例子，因为它们的翻译和后续效应在很大程度上依赖于与其他形式的RNA⁶的接近和相互作用。此外，细胞核和细胞质区域之间的细胞元件交换与对各种癌症治疗的耐药机制有关⁷。细胞内区室的分离允许核输出抑制剂的发展，这减轻了对不同疗法的耐药机制的影响⁸。

分离核和细胞质RNA后，执行步骤以纯化感兴趣的RNA。由于RNA纯化试剂盒通常在实验室中发现，并且具有纯化和分离长RNA的功能，因此它们可以很好地满足本协议的目的。对于RNA纯化，产生大于1.8的260:280比率对于确保RNA测序或其他需要高纯度和分离的类似程序的样品质量至关重要。不规则的 260:280 值表示苯酚污染，表明分离效果差，结果不准确⁹.

一旦RNA纯化完成并且确认260:280值高于可接受的范围，则使用qPCR验证核和细胞质级分的分离结果。在此过程中，使用特定于感兴趣区域的引物来证明核和细胞质分离水平。在该协议中，MALAT1和TUG1分别用作核和细胞质标志物¹⁰。总之，它们允许使用MALAT1证明高水平的核分离，而细胞质分离预计较低。相反，当使用TUG1时，预计细胞质分级水平将高于核分离水平。

利用该协议，可以根据RNA在细胞中的作用位置分离RNA。由于在该实验中广泛使用许多材料，并且仅使用裂解缓冲液和基于密度的离心技术，因此对其他RNA类型和其他细胞组分的适用性很普遍。这可以通过阐明特定于位置的表达事件来提供重要信息，否则如果不进行分离，这些事件将无法区分。

研究方案

K562细胞用于本研究。该协议已经过优化，适用于1 x 10^6-5 x 10⁶⁰⁰ 万个细胞。然而，通过适当增加体积，该程序可以扩大到更大的细胞量。

1.0.25x裂解缓冲液的制备

1. 通过混合 表1A中提供的以下组分制备0.25x裂解缓冲液。
   注意:样品需要大约 300 μL 的 0.25x 裂解缓冲液。推荐体积 = 样品数量 x 300 μL。

2. 核和细胞质组分的分离

1. 使用 1.5 mL 管在 2000 x g（室温）下离心 5 分钟沉淀细胞。使用吸液管弃去上清液。
   注意:在此协议期间使用了K562细胞。然而，该方案可以适应各种细胞系。
2. 将沉淀重悬于300μL冰冷的0.25x裂解缓冲液中。
   注意:在冰上保持2分钟，每45秒旋转一次试管，以确保细胞正确裂解。
3. 在4°C下以最高速度（12，000× g）旋转管2分钟。
4. 离心后，小心地除去上清液并将其放入新的 1.5 mL 管中。这将是细胞质部分。将获得大约 300 μL 的细胞质级分。
5. 剩余的颗粒将是核部分。向沉淀中加入 500 μL 冰冷的 PBS，并在室温下以 2，000 x g 离心 5 分钟。
   注意:在此步骤中，多余的DNA被移除。

3. 使用 RNA 纯化试剂盒进行 RNA 净化

注意:该方案是使用市售RNA纯化试剂盒实现的（参见 材料表）。

1. 分离细胞质RNA样品和核细胞质样品（因为分离步骤在它们之间有所不同）。
   1. 要分离细胞质级分，加入 1，050 μL 3.5x RLT 裂解缓冲液（参见 材料表）并短暂涡旋。然后，加入 750 μL 90% 乙醇，并将其从 RNA 净化试剂盒加载到色谱柱上。
      注意:在将溶液装入色谱柱之前，必须充分混合溶液。
   2. 要分离核级分，加入 600 μL 3.5x 裂解缓冲液并涡旋。然后，加入 600 μL 70% 乙醇。
2. 将细胞质和核级分加载到RNA柱上（参见 材料表）。
   注意:对于步骤3的其余部分，细胞质和核样品都遵循相同的程序。但是，请确保这些样本彼此独立。
   1. 将细胞质和核级分加载到RNA柱上，并在室温下以8，000 x g 离心30秒。丢弃多余的流量。
   2. 从市售纯化试剂盒（RW1缓冲液，参见 材料表）中加入350 μL洗涤缓冲液，再次旋转，并丢弃流出的流量。
   3. 在室温下加入DNA酶溶液（1U / uL）15分钟。然后，加入 350 μL 洗涤缓冲液，再次旋转，并丢弃流出的流量。
   4. 加入 500 μL 温和洗涤缓冲液（RPE，参见 材料表），再次旋转，并丢弃流出的液体。加入 500 μL 温和洗涤缓冲液，再次旋转，但仅 2 分钟。
   5. 将色谱柱移至新的 1.5 mL 微量离心管中，并向离心柱中加入 30 μL 水。让色谱柱静置 1 分钟，然后再旋转。

4. 核-细胞质分离的验证

1. 进行cDNA合成
   1. 提取并纯化RNA的亚细胞区室后，使用qPCR确认区室的分离。为此，首先，按照制造商的说明使用市售试剂盒将RNA转换为cDNA（参见 材料表）。
   2. 制备逆转录酶预混液。添加模板 RNA。在热循环仪中孵育反应。
      注意:对于随机六聚体，使用的循环参数在 表2A中提供。立即使用逆转录酶反应或储存在-20°C（表1B）。
2. 进行定量聚合酶链反应（qPCR）和分析。
   1. 用DEPC水稀释cDNA合成（参见 材料表），最终浓度为20 ng / mL。
   2. 使用PCR预混液，使用下面列出的手动说明为每个样品制备反应。
   3. 获取检测细胞质和细胞核分离所需的商业探针。使用MALAT1作为核标志物，TUG1作为细胞质标志物（见 材料表）。
      注意: 表 3 中提供了 MALAT1 和 TUG1 的序列。
   4. 通过将单个样品的每个技术重复的每个组分乘以 3 来计算每个组分的体积。
   5. 对于每个核和细胞质样品，为每个样品获取以下混合物:（a）具有MALAT1的核级分，（b）具有MALAT1的细胞质级分，（c）具有TUG1的核级分和（d）具有TUG1的细胞质级分（表1C）。
   6. 短暂涡旋以混合溶液，并将 20 μL 混合物转移到光学反应板的每个孔中（参见 材料表）。
   7. 用用于qPCR的透明胶膜覆盖板（参见 材料表），并短暂离心板以消除气泡，然后在室温下以300× g 旋转样品5分钟。
   8. 使用设计和分析软件（见 材料表），选择循环参数的标准曲线（表2B）。
   9. 使用 qPCR 软件，选择 设置运行 （补充图 1）。
   10. 在"数据文件属性"页上，从表 2B 中选择方法和输入周期参数（补充图 2）。
   11. 输入循环参数后，选择 板 选项卡，然后输入要运行的样品（补充图3）。选择 "开始运行"。
       注意:所述步骤是使用市售预混液在qPCR仪中进行的（参见 材料表）。
3. 执行数据分析
   1. 运行完成后，创建一个数据电子表格，其中包含样品名称、靶标名称和定量周期（Cq）（补充表1）。
   2. 从MALAT1样品开始计算核分数。从MALAT1核部分减去MALAT1细胞质部分（表4）。
   3. 然后，计算 ΔCq （2^（-值））（表 5）。
   4. 继续使用MALAT1样品计算细胞质级分，从MALAT1细胞质级分中减去MALAT1核级分，然后计算ΔCq（2^（-值））（表6）。
      注意:观察ΔCq，观察到核MALAT1级分（绿色高亮）比细胞质（红色高亮）具有更大的MALAT1标记，但现在需要确认以确保细胞质部分主要是细胞质并且核级分不含细胞质污染。
   5. 对于TUG1样品，执行与上述相同的计算（步骤4.3.2-4.3.4）（表7）。
      注意:观察ΔCq，观察到细胞质TUG1级分（绿色突出显示）比核级分（红色突出显示）具有更大的TUG1标记，从而确认了细胞质和核级分的良好分离（表8， 图1）。

结果

为了确保实现核和细胞质分离，进行了qPCR以验证结果。在此过程中，使用特定于感兴趣区域的引物来证明核和细胞质分离水平。在这项研究中，MALAT1和TUG1分别用作核和细胞质引物。总之，它们允许证明高水平的核分级分离，MALAT1作为核元素的阳性对照，而细胞质分离预计较低。相反，当TUG1作为细胞质元件的阳性对照存在时，预计细胞质分离水平将高于核分离水平。这可以在 图2

讨论

在整个方案中，采取了一些步骤来优化元件，使其对感兴趣的细胞系最有效。虽然协议中的步骤相对简单，但在协议的关键方面可能需要分析和细微调整。方案中最关键的步骤是根据感兴趣的细胞系和细胞靶标将裂解缓冲液的浓度修改为适当的浓度。由于裂解缓冲液的使用在很大程度上取决于细胞膜的破坏，因此裂解缓冲液在不同细胞系上的有效性存在自然差异，因为不同细胞系之间的细胞脆性?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent Tapestation	Agilent	G2991BA	The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples.
0.5% Nonidet P-40	Thermo-Fischer	28324	Used in the making of lysis buffer
50 mM Tris-Cl pH 8.0	Thermo-Fischer	15568025	Used in the making of lysis buffer
MALAT1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00273907_s1	Utilized for confirmation of Nuclear fraction.
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode	Thermo-Fischer	4326659	The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo-Fischer	4311971	The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR
PBS	Gibco	20012-023	Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents.
Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit	Qiagen	74106	RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol.
QuantStudio 6	Thermo-Fischer	A43180	qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples
RLT Buffer	Qiagen	79216	Lysis Buffer from RNA clean-up kit
RPE Buffer	Qiagen	1018013	Wash Buffer from RNA clean-up kit
RW1 Buffer	Qiagen	1053394	Wash Buffer from RNA clean-up kit
Taqman Gene Expression Assays	Thermo-Fischer	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves.
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo-Fischer	4305719	TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time.
TUG1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00215501_m1	Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction.
UltraPure DEPC-Treated Water	Thermo-Fischer	750024	UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered.