猪视网膜色素上皮细胞原代培养

摘要

本文介绍了一种易于遵循的体 外 培养原代猪视网膜色素上皮细胞的方法。

摘要

视网膜色素上皮（RPE）是单层极化色素上皮细胞，位于视网膜的脉络膜和神经视网膜之间。多种功能，包括吞噬作用，营养/代谢物运输，维生素A代谢等，由RPE每天进行。RPE细胞是终末分化的上皮细胞，具有很少或没有再生能力。RPE细胞的缺失会导致多种眼部疾病，导致视力障碍，例如年龄相关性黄斑变性。因此，建立原代RPE细胞的 体外 培养模型，其与 体内 RPE比细胞系更相似，对于RPE细胞的特征和机理研究至关重要。考虑到人类眼球的来源有限，我们创建了一个培养原代猪RPE细胞的方案。通过使用该方案，RPE细胞可以很容易地从成年猪眼球中解离。随后，这些解离的细胞附着在培养皿/插入物上，增殖形成汇合的单层，并在2周内快速重建 体内 上皮组织的关键特征。通过qRT-PCR，证明原代猪RPE细胞表达的多个特征基因与天然RPE组织相当，而这些基因中的大多数在人RPE样细胞ARPE-19中丢失/高度降低。此外，免疫荧光染色显示紧密连接、组织极性和细胞骨架蛋白的分布，以及培养的原代细胞中存在对维生素 A 代谢至关重要的异构酶 RPE65。总之，我们开发了一种易于遵循的方法来培养具有高纯度和天然RPE特征的原代猪RPE细胞，这可以作为了解RPE生理学，研究细胞毒性和促进药物筛选的良好模型。

引言

视网膜色素上皮 （RPE） 位于视网膜¹ 外层的感光器和脉络膜毛细血管之间，具有多种功能，包括形成血液-视网膜屏障、运输和交换营养物质和视网膜代谢物、回收维生素 A 以维持正常的视觉周期，以及吞噬和清除脱落的感光器外段 （POS）^2，3.由于POS需要不断的自我更新才能产生视力，因此RPE细胞需要不断吞噬分离的POS以维持视网膜稳态⁴。因此，RPE功能障碍导致许多致盲性眼病，如年龄相关性黄斑变性（AMD）⁴，视网膜色素变性（RP）⁵，Leber先天性黑朦^{6，糖尿病}视网膜病变⁷等。到目前为止，大多数这些疾病的确切发病机制仍然难以捉摸。因此，建立了RPE细胞培养来研究RPE细胞生物学，病理变化和潜在机制。

作为研究细胞生物学的最简单模型，RPE细胞的培养早在1920^{年代就开始}了8。尽管ARPE-19被广泛用作RPE细胞，但色素沉着的丧失，鹅卵石形态，特别是该细胞系中的屏障功能引起了^{很多关注9}。相比之下，原代人RPE细胞的培养为生理和病理研究提供了更现实的场景⁹。然而，相对有限的可用性限制了它们的使用，道德问题始终存在。此外，几个小组使用小鼠模型培养RPE细胞。但小鼠眼睛尺寸小，单一培养通常需要多只小鼠，不方便⁹.最近，科学家们开发了利用人类胚胎干细胞或诱导多能干细胞来衍生RPE细胞的新方法。尽管该技术在治疗遗传性RPE疾病方面具有特殊潜力，但它非常耗时，通常需要几个月才能产生成熟的RPE细胞¹⁰。为了克服这些问题，我们在这里介绍了一种易于遵循的方案，用于在实验室中常规分离和培养高纯度RPE细胞。在合适的培养条件下，这些细胞可以显示出典型的RPE功能并表现出典型的RPE形态。因此，该培养方法可为了解RPE生理学、研究细胞毒性、研究相关眼病的病理机制、进行药物筛选提供良好的模型。

研究方案

实验动物的使用符合视觉与眼科研究协会（ARVO）的规定，并得到厦门大学实验动物管理伦理委员会的批准。

1. 实验手术器械、组织消化酶、细胞培养缓冲液的制备

1. 准备实验性手术装置，在眼球解剖前一天清洁并高压灭菌两对眼科手术剪刀和镊子，然后在65°C的通用方案烤箱中用手术器械干燥盒子过夜。
2. 培养基制备。
   1. 制备补充有 10% （v/v） 胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺和 1% （v/v） 青霉素 （100 U/mL） 和链霉素 （100 U/mL） 的 DMEM/碱性培养基。
   2. 制备补充有 1% （v/v） FBS 和 1% （v/v） 青霉素 （100 U/mL） 和链霉素 （100 U/mL） 的 DMEM/F12 培养基。
   3. 制备 MEM-Nic 11，通过补充 MEM α 加入 2 mM L-谷氨酰胺、1% FBS、1% （v/v） 青霉素 （100 U/mL） 和链霉素 （100 U/mL）、0.1 mM NEAA、1% （v/v） N1 补充剂、牛磺酸 （0.25 mg/mL）、氢化可的松 （20 ng/mL）、三碘甲状腺素 （0.013 ng/mL） 和¹⁰ mM 烟酰胺。
      注意:为了提高细胞活力和增殖，FBS的百分比可以增加到20%，以中和消化酶并接种解离的细胞。对于长期细胞培养，FBS的百分比可以降低到1%¹²。
3. 在实验过程中解冻组织消化酶等分试样（补充有0.91mM EDTA的0.25%（w / v）胰蛋白酶/ EDTA溶液，以下简称胰蛋白酶/ EDTA溶液）。
   注意:每次都应使用新鲜胰蛋白酶/ EDTA溶液以获得最佳结果。将10mL新鲜胰蛋白酶/ EDTA溶液等分到每个15mL无菌离心管中，并在-20°C冰箱中冷冻等分试样直至使用。
4. 解剖溶液。
   1. 通过 0.22 μm 注射器过滤装置过滤溶液，对补充有 2% （v/v） 青霉素 （100 U/mL） 和链霉素 （100 U/mL） 的 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） （pH 7.2） 进行灭菌。
5. 涂覆培养板和透孔插入物。
   1. 用 1x PBS 清洗孔和跨孔插入物。用移液管从孔和转孔中取出PBS，然后向下室中加入1 mL新鲜的1x PBS，向上室中加入600 μL 10 μg/ mL层粘连蛋白溶液。
   2. 将板/跨孔插入物在细胞培养箱中在37°C和5%CO₂下孵育过夜。从上室取出层粘连蛋白溶液，并在接种细胞之前用 1 mL 冷的 1x PBS 洗涤两次。

2.解剖猪眼球RPE细胞

1. 准备仪器。
   1. 用75%乙醇和紫外线清洁层流罩。准备三个含有~25 mL 75%乙醇的50 mL无菌离心管，三个含有~25 mL 1x PBS的50 mL无菌离心管和三个含有~15 mL 1x PBS的10 cm无菌细胞培养皿。
      注意:这些设置通常用于解剖四个猪眼球。当使用更多眼球时，请放大。为了提高细胞活力，在冰上预冷1x PBS缓冲液至少30分钟。75%乙醇和紫外光都是确保实验仪器和细胞不受污染所必需的。提前打开紫外灯，对整个手术台进行消毒至少15分钟。
2. 清洁猪眼球。
   1. 从屠宰场获得新鲜的眼球，并将它们放在冰上直到解剖。将四个猪眼球浸泡在 10 cm 培养皿中的 ~15 mL 75% 乙醇中，并使用一把剪刀和镊子切断所有残留的结缔组织和肌肉。
      注意:从巩膜外部尽可能多地去除组织以减少污染。此时不要切断视神经，以方便在去污和洗涤步骤中转移眼球。在此步骤之后，所有程序都应在层流罩中进行。
3. 依次浸泡并清洗四个猪眼球，依次浸泡并清洗三个装有 75% 乙醇的 50 mL 无菌离心管，对猪眼球进行净化;每个眼球在每个管中浸泡至少5分钟。接下来，在三个装有 1x PBS 的 50 mL 无菌离心管中依次清洗猪眼球;在每个管中洗涤每个眼球至少5分钟（图1A）。每分钟倒置一次管子以彻底清洗眼球。
4. 解剖猪眼球。
   1. 将四个猪眼球移动到含有1x PBS的10cm无菌细胞培养皿中。再次修剪每个眼球的外表面以去除视神经和小碎片（图1B）。用剪刀在角膜缘和巩膜的交叉处做一个小切口，然后去除角膜、虹膜、晶状体、玻璃体和神经视网膜（这些组织的详细结构请参考 图1）。
   2. 将RPE-脉络膜-巩膜复合物转移到新的10厘米细胞培养皿中，并进行四次切割以将眼罩平整成四叶草的形状（图1C）。
5. 通过将四个RPE-脉络膜-巩膜复合物放入新的10厘米培养皿中进行胰蛋白酶/ EDTA溶液消化。倒入20mL新鲜胰蛋白酶/ EDTA溶液以合并RPE-脉络膜-巩膜复合物，并将培养皿放入37°C的细胞培养箱中~30分钟。
   注意:使用新鲜的胰蛋白酶/ EDTA溶液解离RPE细胞。仔细控制胰蛋白酶/EDTA溶液消化的时间，因为较长的孵育时间（超过30分钟）可能会增加其他类型细胞的污染。

3. 猪眼球RPE细胞的分离培养

1. RPE 解离。
   1. 用胰蛋白酶/EDTA 溶液孵育 30 分钟后，将培养皿从培养箱中取出，并向培养皿中加入 20 mL 预热培养基（含 10% FBS）以中和胰蛋白酶/EDTA 溶液。
      注:在此步骤中，仅使用 DMEM/基本介质。当细胞达到汇合时，可以根据实验条件使用三种培养基:DMEM/碱性培养基、DMEM/F12培养基和MEM-Nic培养基。
   2. 使用 5 mL 移液器通过轻轻移液数次解离 RPE 细胞。将细胞悬液收集到 15 mL 离心管中。使用另外 10 mL 新鲜培养基 （10% FBS） 轻轻移液以洗涤培养皿上的 RPE-脉络膜-巩膜复合物以获得尽可能多的 RPE 细胞。
      注意:不要用力研磨细胞。确保以约 3 mL/s 的速度填充和清空移液器。避免使细胞悬液冒泡。
2. 通过在室温下以200× g 离心管5分钟来收集RPE细胞。使用移液管吸出上清液并加入另外 5 mL 培养基 （10% FBS） 以重悬细胞并以 200 x g 离心再 5 分钟。倒出上清液并用 12 mL 培养基重悬细胞。
   注意:吸出上清液时，留下约1 mL培养基以避免细胞团块破裂。
3. 接种 RPE 细胞。
   1. 将~1-2 x 10⁵ 个细胞/孔接种到12孔培养板或跨孔插入物中。通常，从四个猪眼球中获得约1.5 x 10⁶ 个RPE细胞。每2天更换一次培养基，当细胞完全覆盖孔/插入物的表面时，将血清浓度降低至1%。
      注意:在细胞附着到培养皿/插入物之前，不要过于频繁地移动细胞培养皿。
4. 每2天更换一次培养基，直到收获细胞。
   注意:细胞达到汇合后，FBS的浓度可以降低，细胞可以培养长达几个月以允许完全分化和成熟。

4. 原代猪RPE细胞的表征

1. 将细胞汇合培养1或2周，然后收获细胞进行进一步分析。
2. 收获细胞进行实时定量 PCR （qRT-PCR） 分析。
   1. 取出培养基，用 1 mL 冷的 1x PBS 洗涤细胞，然后将 500 μL RNA 提取溶液加入每个孔中，以从约 1 x 10⁶ 个细胞中收集细胞裂解物。
   2. 提取mRNA¹³;从每个样品中提取约4μgRNA。使用 100 ng 的 mRNA 进行逆转录¹⁴;将cDNA稀释40倍以进行实时定量PCR分析。引物列于 表1中。
3. 收获细胞进行免疫荧光染色。
   1. 取出培养基，用 1 mL 冷的 1x PBS 洗涤细胞，然后在 1x PBS 中加入 500 μL 4% （w/v） 多聚甲醛，以固定细胞（约 1 x 10⁶ 细胞/孔）在室温下 30 分钟。然后，用1x PBS洗涤细胞两次，并在4°C下用一抗（1x PBS中的1:100补充有1%（w / v）牛血清白蛋白）进行免疫荧光染色过夜，二抗（1x PBS中的1:200补充有1%（w / v）牛血清白蛋白）在室温下根据在线方案²小时。
   2. 免疫荧光图像按照在线手册¹⁶通过共聚焦显微镜获取。
4. 收获细胞进行蛋白质印迹分析。
   1. 取出培养基，用冷的1x PBS洗涤细胞两次，然后将80μLRIPA缓冲液（含1x蛋白酶抑制剂）加入每个孔中，并使用细胞刮刀从培养皿/插入物上刮擦约1 x 10⁶ 个细胞。
   2. 从每个孔/插入 1.5 mL 微量离心管中收集细胞裂解物。将细胞裂解物煮沸10分钟，然后使用BCA试剂盒测量蛋白质浓度;每个样品的蛋白质浓度约为2 mg/mL。根据在线方案，使用每个样品的 25 μg 蛋白质进行蛋白质印迹分析¹⁷。
   3. 对于蛋白质印迹，将膜在 5 mL 一抗溶液中孵育（在 1x TBST 溶液中以 1:1，000 稀释的一抗，补充有 5% （w/v） 牛血清白蛋白）在 4 °C 下在旋转的多用途摇床上孵育过夜。
   4. 然后，根据所用一抗的来源，将膜与约15mL抗兔或抗小鼠二抗溶液（在补充有5%（w / v）脱脂牛奶的1x TBST溶液中1:5，000稀释的二抗）在室温下在轨道振荡器上孵育2小时。
5. 跨上皮阻力 （TER） 测量。
   1. 用70%乙醇和无菌1x PBS顺序洗涤筷子电极。然后将电极的较短端放在顶腔室中，将较长的端放在Transwell插入物的底部腔室中，然后单击上皮电压表上的按钮进行测量。一式三份记录每个孔的TER测量值。

结果

将原代猪RPE（pRPE）细胞在含有10%FBS的DMEM/碱性培养基中培养，并在接种后2天（图2A）、6天（图2B）和10天（图2C）在光学显微镜下拍摄细胞形态。1周后，观察到具有鹅卵石形态的单层色素沉着pRPE细胞汇合。

为了更好地表征原代pRPE细胞，将传代3（P3）^18和ARPE-19细胞的原代人RPE细胞（hRPE）在DME...

讨论

在这里，描述了用于从猪眼球中分离，培养和表征RPE细胞的详细和优化方案，该方案为RPE细胞的体外表征和RPE相关疾病研究提供了良好的模型。从人，小鼠和大鼠眼睛中分离RPE的方法已在前面描述过²³，^24，25。然而，在一些实验室中很难获得人类的眼球，并且通常会引发伦理问题。小鼠和大鼠的RPE组织相对较小，细胞在...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ARPE-19 cells	CCTCC	GDC0323
Bovine serum albumin	Yeasen	36101ES60
Confocal microscopy	Zeiss	LSM 880 with Airyscan
ChemiDoc Touch	Bio-Rad	1708370
Cell scraper	Sangon	F619301
10 cm culture dish	NEST	121621EH01
12-well culture plate	NEST	29821075P
DMEM F12 Medium	Gibco	C11330500BT
DMEM basic Medium	Gibco	C11995500BT
EVOM2	World Precision Instruments	EVOM2	For TER measurement
Fetal bovine serum	ExCell Bio	FSP500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-11034
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-11012
Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP	Bio-Rad	0300-0108P
Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP	Bio-Rad	5196-2504
hydrocortisone	MCE	HY-N0583/CS-2226
Hoechst 33342 solution (20 mM)	ThermoFisher Scientific	62249
LightCycler 96 Instrument	Roche	5815916001
Liothyronine	MCE	HY-A0070A/CS-4141
laminin	Sigma-Aldrich	L2020-1MG
MEM(1X)+GlutaMAX Medium	Gibco	10566-016
MEM NEAA(100X)	Gibco	11140-050
Millex-GP syringe filter unit	Millipore	SLGPR33RB
N1	Sigma-Aldrich	SLCF4683
NcmECL Ultra	New Cell&Molecular Biotech	P10300
Non-fat Powdered Milk	Solarbio	D8340
Nicotinamide	SparkJade	SJ-MV0061
Na+-K+ ATPase antibody	Abcam	ab76020	Recognize both human and porcine proteins
PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%)	Epizyme	PG112
primary Human RPE cells	-	-	Generous gift from Shoubi Wang lab
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
Prism	GraphPad by Dotmatics	version 8.0
Protease Inhibitor Cocktails	APExBIO	K1024
PRE65 antibody	Proteintech	17939-1-AP	Recognize both human and porcine proteins
PEDF antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-390172	Recognize both human and porcine proteins
100 x penicillin/streptomycin	Biological Industries	03-031-1BCS
Phosphate buffered saline (PBS)	RARBIO	RA-9005
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix	Toyobo	FSQ-201
RIPA buffer	ThermoFisher Scientific	89900
15 mL sterile centrifuge tubes	NEST	601052
50 mL sterile centrifuge tubes	NEST	602052
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
Taurine	Damas-beta	107-35-7
Trizol	Thermo-Fisher	15596026	RNA extraction solution
TB Green Fast qPCR Mix	Takara	RR430A
12-well transwell inserts	Labselect	14212
VEGF antibody	Proteintech	19003-1-AP	Recognize both human and porcine proteins
VEGF ELISA kit	Novusbio	VAL106
ZO-1 antibody	ABclonal	A0659	Recognize both human and porcine proteins