使用系绳上的锍中心构建环肽

摘要

该协议介绍了通过半胱氨酸和蛋氨酸之间的双烷基化以及由炔丙基锍中心触发的简单硫醇 - 炔反应 合成 环肽。

摘要

近年来，环肽因其优异的生物活性而在药物发现领域受到越来越多的关注，因此，它们现在被临床使用。因此，寻求合成环肽的有效策略以促进其在药物发现领域的应用至关重要。本文报告了使用树脂上或分子内（分子间）联烷基化高效合成环肽的详细方案。使用该协议，利用固相肽合成，半胱氨酸（Cys）和蛋氨酸（Met）同时偶联在树脂上，从而合成线性肽。此外，使用可调系绳和系绳上的锍中心通过Met和Cys之间的联烷基化合成环肽。整个合成路线可分为三个主要过程：Cys在树脂上的脱保护，接头的偶联以及Cys与Met在三氟乙酸（TFA）裂解溶液中的环化。此外，受锍中心反应性的启发，炔丙基连接到Met上以触发硫醇-炔基加成并形成环肽。之后，将粗肽干燥并溶解在乙腈中，分离，然后通过高效液相色谱（HPLC）纯化。采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）确认了环肽的分子量，并利用HPLC进一步确认了环肽与还原剂组合的稳定性。此外，通过1 H核磁共振（¹H NMR）波谱分析了环肽中的化学位移。总体而言，该协议旨在建立合成环肽的有效策略。

引言

蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）¹在药物研发中起着关键作用。通过化学方法构建具有固定构象的稳定肽是开发^PPIs模拟基序的最重要方法之一2。迄今为止，已经开发了几种靶向PPI的环肽用于临床³。大多数肽被限制在α螺旋构象中，以降低构象熵并改善代谢稳定性、靶标结合亲和力和细胞通透性^4，5。在过去的20年中，Cys⁶，⁷，赖氨酸⁸，⁹，色氨酸¹⁰，精氨酸¹¹和Met ¹²，¹³的侧链已入到非天然氨基酸中^，以将肽固定成环状构象。这种环肽可以靶向独特的化学空间或特殊位点，从而触发共价反应以形成蛋白质-肽共价结合^14，15，¹⁶<....

研究方案

1. 设备准备

注意：吗啉、N，N-二甲基甲酰胺 （DMF）、二氯甲烷 （DCM）、N，N-二异丙基乙胺 （DIPEA）、TFA、吗啉、哌啶、乙醚和甲醇有毒、易挥发和腐蚀性。这些试剂会通过吸入、摄入或皮肤接触对人体造成伤害。对于所有化学实验，请使用防护设备，包括一次性手套、实验外套和防护眼镜。

1. 通过标准手动Fmoc固相肽合成（SPPS）²⁹在Rink-酰胺4-甲基二苯甲胺（MBHA）树脂上构建所有肽底物，如图 1所示。
2. 使用两种选择中的任何一种来构建线性肽：一种，利用缩合剂2-（7-氮杂苯并三唑-1-基）-N，N，N'，N'-四甲基六氟磷酸脲（HATU）和DIPEA试剂合成肽;或二，利用1-羟基苯并三唑（HOBT）和N，N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）作为酰胺缩合试剂合成。根据肽的序列选择合适的肽合成方案。
3. 要建立手动肽合成装置，请在通风橱中设置改进的真空固相萃取设备，并用三通旋塞阀连接。接下来，在连接到氮气（N₂）气体的同时，将聚丙烯滤芯或玻璃反应器放在设备上。
   注意：要修改真空固相萃取设备，请拆下萃取管并保持真空密封系统。
4. 将MBHA树脂装入树脂填充的色谱柱中，并将其溶解在DMF中。调整三通旋塞阀的开关以进行N₂

结果

所有线性肽均在Rink-amide MBHA树脂上通过标准手工Fmoc固相合成合成。如图5A所述构建环状六肽（Ac（环I）-wmaaac-nh₂）模型。值得注意的是，通过Met烷基化产生了一个新的系绳手性中心，反相HPLC确认了环肽的两种差向异构体（Ia，Ib）。此外，使用反相HPLC的积分测定差向异构体的转化率和比例。由六肽Ac-WMAAAC-NH₂产生的环AC-（环I）-WMAAAC-NH₂肽1-Ia和1-Ib表现?.......

讨论

本文描述的合成方法提供了一种在肽序列中使用Cys和Met合成环肽的方法，其中基本线性肽通过常见的固相肽合成技术构建。对于Cys和Met之间环肽的双烷基化，整个合成路线可分为三个主要过程：Cys在树脂上的脱保护，接头的偶联以及Cys和Met在三氟乙酸裂解溶液中的环化。值得注意的是，Cys保护基团的去除被发现是随后闭环反应的关键步骤。因此，trt-Cys被去保护，直到溶液没有明显的黄色。进一步.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,3-bis(bromomethyl)-benzen	Energy	D0215
1,3-Dimethylbarbituric acid	Energy	A46873
1H NMR and HSQC	Bruker	AVANCE-III 400
1-Hydroxybenzotriazole hydrate	Energy	E020543
2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)	Energy	A1797
2-mercaptopyridine	Energy	Y31130
6-Aminocaproic acid	Energy	A010678
Acetic anhydride	Energy	A01021454
Acetonitrile	Aldrich	9758
Ammonium carbonate	Energy	12980
Dichloromethane (DCM)	Energy	W330229
Digital Heating Cooling Drybath	Thermo Scientific	88880029
Diisopropylethylamine (DIPEA)	Energy	W320014
Dimethyl formamide (DMF)	Energy	B020051
Dithiothreitol	Energy	A10027
Electrospray Ionization Mass	SHIMADZU2020	LC-MS2020
Fmoc-Ala-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R30101
Fmoc-Arg(Pbf)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R30201
Fmoc-Cys(Trt)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R30501
Fmoc-Gln(Trt)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R30601
Fmoc-Glu(OtBu)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R30701
Fmoc-His(Boc)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R30902
Fmoc-Ile-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31001
Fmoc-Lys(Boc)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31201
Fmoc-Met-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31301
Fmoc-Pro-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31501
Fmoc-Ser(tBu)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31601
Fmoc-Thr(tBu)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31701
Fmoc-Trp(Boc)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31801
Fmoc-Tyr(tBu)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31901
Fmoc-Val-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R32001
Formic acid	Energy	W810042
High Performance Liquid Chromatography	SHIMADZU	LC-2030
Methanol	Aldrich	9758
Morpholine	Aldrich	M109062
N,N'-Diisopropylcarbodiimide	Energy	B010023
Ninhydrin Reagent	Energy	N7285
Propargyl bromide	Energy	W320293
Rink Amide MBHA resin	Nanjing Peptide Biotech Ltd.
Solid Phase Extraction (SPE) Sample Collection Plates	Thermo Scientific	60300-403
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium	Energy	T1350
Three-way stopcocks	Bio-Rad	7328107
Triethylamine	Energy	B010737
Trifluoroacetic acid (TFA)	J&K	101398
Triisopropylsilane (TIS)	Energy	T1533