纳米巴支持的脂质双层系统，用于体外研究膜曲率传感蛋白

摘要

在这里，开发了一种纳米巴支持的脂质双层系统，以提供具有定义曲率的合成膜，从而能够在 体外表征具有曲率传感能力的蛋白质。

摘要

膜曲率在细胞的各种基本过程中起着重要作用，例如细胞迁移、细胞分裂和囊泡运输。它不仅由细胞活动被动产生，而且还主动调节蛋白质相互作用并参与许多细胞内信号传导。因此，研究膜曲率在调节蛋白质和脂质的分布和动力学中的作用具有重要价值。最近，已经开发了许多技术来研究体 外弯曲膜和蛋白质之间的关系。与传统技术相比，新开发的纳米巴支持的脂质双层（SLB）通过在具有预定义膜曲率和局部平坦控制的纳米条图案阵列上形成连续的脂质双层，在膜曲率生成方面提供了高通量和更高的精度。脂质流动性和蛋白质对弯曲膜的敏感性都可以使用荧光显微镜成像进行定量表征。本文介绍了如何在含有纳米棒阵列的人造玻璃表面上形成SLB的详细程序，以及如何在这种SLB上表征曲率敏感蛋白。此外，还涵盖了纳米芯片重用和图像处理的协议。除了纳米巴-SLB，该协议还适用于用于曲率传感研究的所有类型的纳米结构玻璃芯片。

引言

膜曲率是细胞的关键物理参数，发生在各种细胞过程中，例如形态发生、细胞分裂和细胞迁移¹.现在人们普遍认为，膜曲率不仅仅是细胞事件的简单结果;相反，它已成为蛋白质相互作用和细胞内信号传导的有效调节剂。例如，发现参与网格蛋白介导的内吞作用的几种蛋白质优先与弯曲膜结合，导致内吞作用²的热点形成。膜变形有许多不同的原因，例如细胞骨架力拉动膜，存在不同大小头基的脂质不对称性，存在锥形跨膜蛋白，膜成形蛋白如BAR结构域蛋白（以Bin，两栖蛋白和Rvs蛋白命名）的积累，以及两亲性螺旋结构域插入膜¹.有趣的是，这些蛋白质和脂质不仅使膜变形，而且还可以感知膜曲率并表现出优先积累^1。因此，研究具有不同曲率的膜是否以及如何改变附着在其上的蛋白质和脂质的分布和动力学以及对相关细胞内过程的潜在影响至关重要。

已经开发了许多技术来分析活细胞和体外系统中弯曲膜和蛋白质之间的相互作用。活细胞系统提供了一个真实的细胞环境，具有丰富的脂质多样性和动态蛋白质信号传导调节²，³，⁴，⁵，^6，7。然而，由于细胞内环境的不确定性和波动性，这种复杂的系统很难研究。因此，使用由已知脂质种类和纯化蛋白质组成的人造膜的体外测定已成为表征蛋白质和弯曲膜之间关系的强大重构系统。传统上，通过挤出产生不同直径的脂质体，以通过使用离心力的共沉降测定或具有密度梯度的共浮选测定来检测曲率敏感的蛋白质，以避免蛋白质聚集^8，9。然而，挤出脂质体的曲率受到挤出机¹⁰中使用的膜过滤器的可用孔径的限制。单脂质体曲率（SLiC）测定已被证明可以克服这一限制，其中不同直径的脂质体被荧光标记并固定在表面上，以便曲率可以用荧光强度¹¹标记。然而，在小囊泡中观察到脂质组成的强烈变化，这影响了曲率测量的准确性¹²。系绳拉动实验使用光学镊子更准确地测量从巨型单层囊泡 （GUV） 拉出的瞬态系绳上的曲率，其中曲率可以通过产生的膜张力很好地控制^13，14。该方法适用于研究正曲率或负曲率传感蛋白，但受到管生成¹⁰的通量的限制。支持的膜管 （SMrT） 测定可同时生成多个膜管，这些膜管通过微流体流从同一脂质储层挤出。然而，膜曲率沿纳米管固有地变化，这损害了基于荧光强度的曲率测量的准确性^15，16。相比之下，使用小的单层囊泡（SUV，直径<100nm¹⁷）在含有设计形貌的表面上形成支持的脂质双层（SLB），产生单个双层膜，其曲率由纳米制造或纳米材料预先确定，精度^为18，^19，20。

在这里，我们提出了一种在具有纳米棒阵列的制造纳米芯片表面上形成SLB的协议，以及如何使用它来探测 体外蛋白质的曲率敏感性。如图 1所示，该测定有六个基本组成部分:A）用微流体室清洁和组装芯片;B）制备具有确定脂质组成的SUV;C）在纳米芯片上形成SLB并与曲率敏感蛋白结合;D）在荧光显微镜下对SLB和曲率敏感蛋白进行成像和表征;e） 清洁芯片以便重复使用;F）用于定量分析蛋白质曲率传感能力的图像处理。下面将逐步介绍详细的协议。

研究方案

1. 纳米芯片的清洗

1. 将纳米芯片放入 10 mL 烧杯中，图案面朝上。
   注意:该石英纳米芯片已通过电子束光刻 技术制造 ，如^{前所述 21}.芯片上纳米结构的几何形状和排列可以定制设计。这里使用的梯度纳米棒的尺寸为长度为2000 nm，高度为600 nm，宽度为100至1000 nm（步长为100 nm）。
2. 小心地向烧杯中加入 1 mL 98% 硫酸，并确保酸完全覆盖芯片的正面和背面。
   注意:98%的硫酸具有极强的腐蚀性，与皮肤或眼睛接触时会导致快速的组织破坏和严重的化学灼伤。在通风橱中使用它，并提供适当的保护。
3. 缓慢旋转烧杯，逐滴加入 200 μL 30% 过氧化氢，直到整个烧杯变热。确保硫酸和过氧化氢充分混合以形成食人鱼溶液，用于从纳米芯片¹⁷中去除有机分子。有替代技术可以在干净的亲水表面上产生SLB，例如前面描述的紫外线和臭氧暴露²³。
   注意:反应非常放热，会导致溶液沸腾，因此将过氧化氢一滴一滴地添加到硫酸中并保持旋转。
4. 将烧杯放入二次玻璃容器中，并将纳米芯片浸入食人鱼溶液中过夜，以彻底清洁杂质。
   注意:将烧杯放在通风橱中，没有任何盖子，以防反应产生气体。
5. 取出烧杯，小心地将食人鱼溶液移入酸性废物容器中。
6. 将 5 mL 去离子水装入烧杯中以稀释残留的酸并将其丢弃到酸性废物中。重复此步骤五次，并使用5 M NaOH中和酸废物。
7. 用镊子抓住芯片，用连续的去离子水流清洗，彻底去除残留的酸。用 99.9% 的氮气吹干芯片以形成^{SLB 22}。

2. 产生小的单层囊泡 （SUV）

1. 将 100 μL 氯仿加入琥珀色小瓶中。
   注意:氯仿是一种高度挥发的无色液体，吸入或吞咽可能有毒。戴上口罩和手套在通风橱中使用它。
2. 将500μg脂质混合物溶解在氯仿中。这里使用的脂质混合物的组成是89.5摩尔%的鸡蛋磷脂酰胆碱（PC），10摩尔%的脑磷脂酰丝氨酸（PS）和0.5摩尔%的德克萨斯红1，2-二十六烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，三乙基铵盐（德克萨斯红DHPE）。
3. 用99.9%氮气吹干小瓶中的脂质混合物，直到氯仿挥发并且脂质混合物干燥。
   注意:此步骤应在通风橱中执行。吹干时避免液体飞溅。
4. 将没有盖子的琥珀色小瓶中存在的脂质混合物放入铝箔覆盖的真空干燥器中。然后用泵真空干燥样品3小时，使氯仿完全挥发。
5. 向小瓶中加入 250 μL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 缓冲液。涡旋溶液直至均匀。
   注意:PBS缓冲液由150 mM NaCl组成，不含钙，镁和酚红;将pH调节至7.2，使PC和PS脂质双层。
6. 在浴超声仪中以50kHz的频率超声处理脂质混合物30分钟。然后将脂质混合物转移到 1.5 mL 离心管中并用封口膜密封。
7. 将脂质混合物在液氮中冷冻20秒，然后在42°C下在水浴中解冻2分钟。重复冻融循环30次。之后，脂质混合物看起来像透明液体。
   注意:液氮的沸点约为-195.8°C。它可能导致冻伤或低温烧伤。戴上隔热手套在密闭空间内使用。
8. 分别用乙醇，氯仿和甲醇冲洗两个玻璃气密注射器和微型挤出机的连接器。重复冲洗顺序五次以预清洁设备。将它们留在通风橱中，直到有机溶剂完全挥发。
9. 组装微型挤出机设备并将 500 μL PBS 缓冲液通过连接器以预润湿设备，然后从另一个注射器中丢弃缓冲液。此步骤可去除杂质并促进挤出。
10. 将微型挤出机设备与孔径为 100 nm 的聚碳酸酯过滤膜组装。
    注意:滤膜的孔径决定了脂质体的直径。
11. 用其中一个注射器取 500 μL PBS 缓冲液，轻轻将其推入过滤器以填充另一端的第二个空注射器。来回重复挤出三次以检查设备泄漏并从第二个注射器中丢弃缓冲液。
12. 将脂质混合物通过小型挤出机以更换PBS缓冲液。然后来回挤压20次以形成SUV。囊泡的多层特征可能在挤出次数不足的情况下保留，这将影响SLB的形成²³。
13. 从第二个注射器中收集SUV，以减少较大颗粒的污染，并将其转移到1.5 mL离心管中。
    注意:将注射器直接从连接器中取出，以防注射器断裂。
14. 用铝箔包裹管以防止荧光标记的脂质漂白，并将其储存在4°C。通常，SUV 最多可以存放 7 天。

3. 在纳米芯片上形成SLB

1. 用镊子小心地从去离子水中取出清洁的纳米芯片，并用99.9%的氮气吹干。
2. 用空气等离子体处理对纳米芯片进行表面清洁1小时。
3. 将纳米芯片组装在聚二甲基硅氧烷（PDMS）室中，该室由两片PDMS-中间PDMS和顶部PDMS组成（图1A）。中间的PDMS很薄（~0.5毫米），中心有一个大的椭圆形开口，以确保充分暴露在纳米棒图案中。顶部PDMS很厚（~4.0毫米），在椭圆形大开口内有两个小孔，作为液体处理的入口和出口。
   1. 将芯片放在干净的表面上，图案朝上。
   2. 用芯片轻轻覆盖中间的PDMS，并确保整个图案暴露在中间PDMS中椭圆形大开口的中心区域。
   3. 用中间的PDMS覆盖顶部的PDMS，并将其两个小孔保留在中间PDMS的大椭圆孔区域内。然后组装PDMS腔室。
      注:PDMS是使用最广泛的硅基有机聚合物。它具有生物相容性、透明性和可变形性，可设计为用于芯片组装和显微镜下成像的定制形状。更重要的是，它可以在等离子体处理后共价紧紧地粘附在另一个PDMS层或玻璃上，使其适合作为制备SLB的腔室。此步骤可确保PDMS的每一层都紧密贴合，以避免间隙和泄漏。
4. 用移液管将SUV从顶部PDMS上的两个小孔之一装入PDMS室，并在室温下孵育15分钟以形成SLB。
5. 从小孔的一侧轻轻地将PBS缓冲液移入PDMS室，然后用棉签从另一个孔中取出废物，以洗掉未绑定的SUV。然后获取在纳米芯片上形成的SLB（通过光漂白后的荧光回收（FRAP）测试SLB的质量，如步骤4.4所示，并在代表性结果部分中讨论）。
   注意:将PBS缓冲液移入腔室时，移液器吸头应充满缓冲液并与液体表面接触，以避免注入任何气泡。

4. 对SLB和曲率传感蛋白结合在纳米芯片上的成像

注意:本节将取决于可用于实验的显微镜系统。在这里，将描述有关如何执行成像的总体指南。详细设置可以在不同的显微镜设置之间更改。

1. 使用100倍（N.A.1.4）油物镜设置激光扫描共聚焦显微镜。打开ZEN软件，选择可以激发脂质和蛋白质荧光的激发激光功率。选择 采集模式>智能设置>德州红DHPE / EGFP。
2. 使用对焦旋钮调整焦点以定位芯片上的纳米棒，直到纳米条边缘在脂质通道下方清晰。
3. 在添加蛋白质之前，设置如下扫描参数以获得脂质通道的对照图像:帧大小 = 512 像素 x 512 像素（512 像素 x 512 像素，像素大小为 124 nm）， 每像素位数 = 16（16 位深度）， 扫描速度 = 5， 平均 = 4 （平均模式为四次/行）。
4. 通过在随机的单个纳米巴区域漂白荧光标记的脂质双层来进行FRAP测定。
   1. 选中" 实验区域 "和 "漂白" 复选框。绘制一个直径为5μm的圆形区域，该区域的中心可以包括整个纳米棒（纳米棒尺寸为2μm）并添加到 实验区域。输入延时成像参数，如以下示例所示:选择 扫描速度 = 9 和 平均 = 1。选择 时间序列>持续时间 = 100 个周期 和 间隔 = 2 秒。输入漂白参数，如以下示例所示:选中" 在 # 图像之后开始" 复选框，然后选择 三个 图像。
   2. 选中执行 FRAP 的激光复选框并将功率更改为 100.0%。单击 FRAP 实验的开始实验 。
      注意:FRAP是表征细胞分子迁移率的常用方法。如果SLB具有良好的流动性，则漂白区域的荧光将逐渐恢复，因为漂白荧光团扩散出来，而来自其他区域的未漂白荧光团将扩散进来。
5. 将蛋白质溶液加载到PDMS室中并在室温下孵育5分钟，以使蛋白质与SLB结合。
   注意:图2G，H中用于证明脂质组成促进蛋白质在纳米条弯曲SLB上的结合的蛋白质为74μM GFP和79μM GFP-His。这两种蛋白质是没有或带有His标签的绿色荧光蛋白质。图4和图5中用于曲率传感研究的蛋白质为16 μM F-BAR、16 μM IDR FBP17和16 μM FBAR+IDR^FBP17。这三种蛋白质是FBP17的结构域，FBP17是一种典型的BAR蛋白，直观地假设为曲率发生器和传感器。每个蛋白质体积为 20 μL。
6. 重新聚焦纳米棒并重复步骤4.3，拍摄脂质和蛋白质通道的图像，以进行蛋白质曲率传感检测。
7. 重复步骤4.4，对脂质和蛋白质通道进行FRAP测定，并进行延时成像以表征曲率传感蛋白的迁移率。

5. 纳米芯片的再利用

1. 用镊子抓住纳米芯片，小心地将其从 PDMS 室中分离到装满去离子水的 50 mL 烧杯中。
   注意:这是一个关键步骤。防止镊子接触纳米结构，不要强迫芯片分离，以免出现裂纹。
2. 用无水乙醇彻底清洗纳米芯片，以去除附着在表面上的有机残留物。
   注意:用无水乙醇洗涤之前，请使用干净的薄纸去除表面上的水。
   注意:无水乙醇是一种高度挥发且略带危险的化学品。避免接触皮肤和眼睛。戴上口罩和手套在通风橱中使用它。
3. 用大量去离子水彻底清洗芯片以去除残留的乙醇。然后用99.9%的氮气吹干芯片。
   注意:在继续下一步之前，去除芯片上的所有乙醇痕迹很重要，因为食人鱼酸会与有机溶剂发生剧烈反应并可能导致爆炸。
4. 将芯片放入干净的 10 mL 烧杯中，图案面朝上，并用食人鱼溶液清洁芯片以供重复使用，其步骤与"清洁纳米芯片"的步骤相同。

6. 图像量化

1. 旋转显微镜获取的图像，使纳米棒阵列处于垂直位置，以便在斐济软件中进行后续分析。
2. 使用自定义编写的 MATLAB 代码"c_pillarmask_averaging"通过脂质通道和蛋白质通道中的方形掩模（51 像素 x 51 像素）定位单个纳米棒。
   注意:此 MATLAB 代码是专门为纳米芯片设计的。它可以通过链接在GitHub上获得:https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX。
3. 通过 MATLAB 代码"BarGra_avg"中的网格函数，用图像角落处的三个 ROI（5 像素 x 5 像素）减去每个图像的背景信号。该操作旨在纠正由显微镜设置或显微镜载物台上的芯片调平引起的潜在不均匀背景噪声。
4. 使用 MATLAB 代码"BarGra_avg"生成相同大小的纳米条的平均图像，其中每个点是所有单个纳米巴方形掩码中该点的值的平均值。在斐济软件中生成平均图像的3D表面图，以直观地显示纳米棒周围的平均信号分布。选择 分析>面图> 输入 100 作为 面乘数，然后选择 阴影、绘制轴和 平滑复选框。
5. 将每个纳米棒分成三个区域，其中包括两个纳米条端区域和一个纳米条中心区域，以分别通过MATLAB代码"avg_nanobar_quantification"提取其荧光强度。使用"位置"文件根据纳米棒的尺寸调整纳米棒ROI的大小。
6. 将蛋白质强度除以从 MATLAB 代码"avg_nanobar_quantification"中提取的脂质强度，以获得不包括表面积效应的纳米条端密度。
7. 在GraphPad Prism中绘制不同浓度的纳米条端密度以获得结合曲线。打开 分析 菜单。选择非线性 回归（曲线拟合）>绑定 - 饱和度>与希尔斜率函数的特定绑定 ，以使用希尔方程拟合曲线，然后计算 KD 和希尔系数值。
8. 脂质和蛋白质强度在600 nm纳米巴中心使用MATLAB代码"avg_nanobar_quantification"采集到其相应的强度。
9. 使用纳米条端面积除以条中心面积处归一化蛋白质强度的最亮九个像素来量化具有相同大小的纳米条的蛋白质曲率传感，该值称为"端心比"。使用归一化蛋白质强度的比率来归一化脂质强度，以量化不同尺寸的纳米棒的蛋白质曲率感应范围，该值称为"归一化纳米巴末端密度"。这些值由 MATLAB 代码"avg_nanobar_quantification"计算得出。
10. 在斐济软件中加载 FRAP 堆栈映像。选择 FRAP 区域并生成投资回报率。选择 "更多>多重测量 "功能以每次测量 FRAP 区域的强度。在 GraphPad Prism 中绘制强度以生成 FRAP 恢复曲线。

结果

建议使用纳米棒设计来探测正曲率传感蛋白，其两端包含一个半圆，曲率由纳米条宽度定义，中心局部有一个平坦/零曲率控制（图 2A，B）。在纳米棒上成功形成SLB会导致脂质标记信号均匀分布在整个纳米棒表面上，如图 2C所示。来自多个纳米棒的信号可以通过平均单个纳米棒图像来组合（图2D），以便可以最小化不?...

讨论

这里描述的纳米棒-SLB系统提供了几种现有体外测定中优势的独特组合。作为脂质体漂浮或沉降测定，它有效地揭示了蛋白质与高度弯曲的膜的优先结合，但需要的样品要少得多，并且在单个纳米棒^8，29上提供更精确定义的曲率。它还提供广泛的精确控制曲率，可与SLiC测定同时进行比较，较少关注不同曲率下的脂质组成变化，以及随着尺寸低于光...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anhydrous Ethanol	Sigma-Aldrich	100983
Aluminum foil	Diamond	RN0879999FU
Amber Vial	Sigma-Aldrich	27115-U
Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)	Avanti Polar Lipids, Inc.	840032
10 mL Beaker	Schott-Duran	SCOT211060804
50 mL Beaker	Schott-Duran	SCOT211061706
1000 mL Beaker	Schott-Duran	SCOT211065408	The second container
Chloroform	Sigma-Aldrich	V800117
Cotton buds	Watsons
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)	Avanti Polar Lipids, Inc.	790404
Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)	Avanti Polar Lipids, Inc.	840051
F-BAR	Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore		Proteins and peptide
F-BAR+IDR	Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore		Proteins and peptide
GFP	Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore		Proteins and peptide
GFP-His	Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore		Proteins and peptide
GraphPad Prism	GraphPad	V9.0.0
Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS)	Thermo Scientific	H325-500
IDR from human FBP17	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
ImageJ	National Institutes of Health	1.50d
Laser Scanning Confocal Microscopy	Zeiss	LSM 800 with Airyscan	100x (N.A.1.4) oil objective.
Methanol	Fisher scientific	10010240
Mini-extuder	Avanti Polar Lipids, Inc.	610000-1EA
1.5 mL Microtubes	Greiner	616201
MATLAB	Mathworks	R2018b
Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm	Whatman	800309
Phosphate Bufferen Saline (PBS)	Life Technologies Holdings Pte Ltd.	70013
Polydimethylsiloxane (PDMS) Base	Dow Corning Corporation	SYLGARD 184
Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker	Dow Corning Corporation	SYLGARD 184
Plasma Cleaner	HARRICK PLASMA	PDC-002-HP
Quartz Nanochip	Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	795429
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	258105
Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt	Life Technologies Holdings Pte Ltd.	T1395MP
Tweezer	Gooi	PDC-002-HP
Ultrasonic Cleaners	Elma	D-78224
Voterx	Scientific Industries	G560E
Vacuum Desiccator	NUCERITE	5312
Water Bath	Julabo	TW8