口腔插管和通气肺缺血再灌注手术小鼠模型

摘要

一种小鼠手术模型，用于在保持通气和避免缺氧的同时产生左肺缺血再灌注 （IR） 损伤。

摘要

缺血再灌注 （IR） 损伤通常由涉及短暂的血流中断的过程引起。在肺中，孤立的IR允许通过持续的肺泡通气对这一特定过程进行实验研究，从而避免缺氧和肺不张的复合有害过程。在临床环境中，肺缺血再灌注损伤（也称为肺IRI或LIRI）由许多过程引起，包括但不限于肺栓塞，复苏性出血性创伤和肺移植。目前，LIRI的有效治疗选择有限。在这里，我们提出了肺IR的可逆手术模型，包括首先耳廓气插管，然后是单侧左肺缺血和再灌注，保留肺泡通气或气体交换。小鼠接受左开胸术，通过该切开术，左肺动脉暴露，可视化，隔离和使用可逆滑结压缩。然后在缺血期间关闭手术切口，唤醒动物并拔管。随着小鼠自主呼吸，通过释放肺动脉周围的滑结来建立再灌注。这种临床相关的生存模型允许评估肺IR损伤，消退阶段，对肺功能的下游影响，以及涉及实验性肺炎的两次命中模型。虽然技术上具有挑战性，但这种模式可以在几周到几个月内掌握，最终生存率或成功率为80%-90%。

引言

缺血再灌注 （IR） 损伤可能发生在中断一段时间后恢复到器官或组织床的血流。在肺中，IR 可单独发生或与其他损伤过程相关，例如感染、缺氧、肺不张、容积伤（机械通气期间潮气量增加）、气压伤（机械通气期间出现峰值或持续压力）或钝性（非穿透性）肺挫伤¹，^2，3.我们对LIRI的机制以及并发过程（例如感染）对LIRI结局的影响的认识仍然存在一些差距，而且LIRI的治疗选择也很有限。需要纯LIRI的体内模型来单独识别肺IR损伤的病理生理学，并研究其对任何多命中过程的贡献，其中肺损伤是其组成部分。

鼠肺 IR 模型可用于研究多个过程的肺特异性病理生理学，包括肺移植³、肺栓塞⁴ 和复苏后出血性创伤后的肺损伤⁵。目前使用的模型包括外科肺移植⁶，肺门钳夹⁷， 离体 肺灌注⁸和通气肺IR⁹。在这里，我们为无菌性肺损伤的小鼠通气肺IR模型提供了详细....

研究方案

下面描述的所有程序和步骤均已获得加州大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。可以使用任何小鼠品系，尽管与其他菌株相比，某些菌株具有更强烈的肺IR炎症反应¹²。大约12-15周龄（30-40g）或更大的小鼠比年轻小鼠更好地耐受和存活肺IR手术。雄性和雌性小鼠都可用于这些手术。

1. 小鼠插管方案

1. 麻醉和插管准备
   1. 用乙醇棉签擦拭小鼠腹部。用腹膜内注射三溴乙醇（250-400mg / kg）麻醉小鼠。通过缺乏踏板撤回反射来评估适当的麻醉深度。现在或稍后放置眼部润滑软膏（步骤2.1.4）。
      注意：对于此程序，三溴乙醇（和依托咪酯作为替代选择）提供稳定的麻醉平面，而不会影响该手术所需的血流动力学条件。这种麻醉剂仅使用一次，以避免腹膜粘连的风险。也可以使用异氟醚，但我们在这里不使用它。从业者可以自由使用他们认为合适的任何麻醉配方。
   2. 将麻醉小鼠仰卧放在插管架或塑料支架上，由其上门牙悬挂在两个支撑锚上的环形 4-0 缝合线（丝绸或其他）上。
   3. 为了在插管过程中保持鼠标固定，请将胸部下部（或上肢两侧）松散地粘在平台上。
   4. 将光纤柔性灯轻轻地放在鼠标的气管上，略低于声带。调整照明水平，以便在观察小鼠口咽时仅可见暗场，但从声带下方发出的红光除外，从而显示最终放置气管插管的目标。请注意，声带运动应该....

结果

单侧通气无菌肺缺血再灌注（IR）损伤引起的炎症：缺血1小时后，我们观察到ELISA和qRT-PCR在再灌注后1小时血清和肺组织中的细胞因子水平升高，在再灌注后12-24小时内迅速恢复到基线¹³。对于再灌注后3小时收集的样品，我们观察到左肺组织内的强烈中性粒细胞浸润，并注意到炎症的强度取决于所使用的小鼠菌株（图1）。值得注意的是，在没有共存或随后的.......

讨论

这份手稿详细介绍了执行由 Dodd-o 等人开发的通气肺 IR 模型所涉及的^步骤9。该模型有助于确定参与分离肺IR的炎症产生和解决的分子途径14，^15，16，17，肺IR与共存感染的结合^18，以及肺IR与肠 - 肺轴的关系以及肠道微生物组的贡献13，^18，

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Fiber Optic Light Pipe	Cole-Parmer	UX-41720-65	Fiberoptic light pipe
Fiber Optic Light Source	AmScope	SKU: CL-HL250-B	Light source for fiberoptic lights
Germinator 500	Cell Point Scientific, Inc.	No.5-1450	Bead Sterilizer
Heating Pad	AIMS	14-370-223	Alternative option
Lithium.Ion Grooming Kits(hair clipper)	WAHL home products	SKU 09854-600B	To remove mouse hair on surgical site
Microscope	Nikon	SMZ-10	Other newer options available at the company website
MiniVent Ventilator	Havard Apparatus	Model 845	Mouse ventilator
Ultrasonic Cleaner	Cole-Parmer	UX-08895-05	Clean tools that been used in operation
Warming Pad	Kent Scientific	RT-0501	To keep mouse warm while recovering from surgery
Weighing Scale	Cole-Parmer	UX-11003-41	Weighing scale
Surgery Tools
4-0 Silk Suture	Ethicon	683G	For closing muscle layer
7-0 Prolene Suture	Ethicon Industry	EP8734H	Using for making a slip knot of left pulmonary artery
Bard-Parker (11) Scalpel (Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade, sterile, single use)	Aspen Surgical	372611	For entering thoracic cavity (option 1)
Bard-Parker (12) Scalpel	Aspen Surgical	372612	For entering thoracic cavity (option 2)
Extra Fine Graefe Forceps	FST	11150-10	Muscle/rib holding forceps
Magnetic Fixator Retraction System	FST	1. Base Plate (Nos. 18200-03) 2. Fixators (Nos. 18200-01) 3. Retractors (Nos. 18200-05 through 18200-12) 4. Elastomer (Nos.18200-07) 5. Retractor(No.18200-08)	Small Animal Retraction System
Monoject Standard Hypodermic Needle	COVIDIEN	05-561-20	For medication delivery IP
Narrow Pattern Forceps	FST	11002-12	Skin level forceps
Needle holder/Needle driver	FST	12565-14	for holding needles
Needles	BD	305110	26 gauge needle for externalizing slipknot (24 or 26 gauge needle okay too)
PA/Vessel Dilating forceps	FST	00125-11	To hold PA; non-damaging gripper
Scissors	FST	14060-09	Used for incision and cutting into the muscular layer durging surgery
Ultra Fine Dumont micro forceps	FST	11295-10 (Dumont #5 forceps, Biology tip, tip dimension:0.05*0.02mm,11cm)	For passing through the space between the left pulmonary artery and bronchus
Reagents
0.25% Bupivacaine	Hospira, Inc.	0409-1159-02	Topical analgesic used during surgical wound closure
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol)	Sigma-Aldrich	T48402-25G	Anesthetic, using for anesthetize the mouse for IR surgery, the concentration used in IR surgery is 250-400 mg/kg.
Buprenorphine	Covetrus North America	59122	Analgesic: concentration used for surgery is 0.05-0.1 mg/kg
Eye Lubricant	BAUSCH+LOMB	Soothe Lubricant Eye Ointment	Relieves dryness of the eye
Povidone-Iodine 10% Solution	MEDLINE INDUSTRIES INC	SKU MDS093944H (2 FL OZ, topical antiseptic)	Topical liquid applied for an effective first aid antiseptic at beginning of surgery
Materials
Alcohol Swab	BD brand	BD 326895	for sterilzing area of injection and surgery
Plastic film	KIRKLAND	Stretch-Tite premium	Alternative for covering the sterilized surgical field (more cost effective)
Rodent Surgical Drapes	Stoelting	50981	Sterile field or drape for surgical field
Sterile Cotton Tipped Application	Pwi-Wnaps	703033	used for applying eye lubricant
Top Sponges	Dukal Corporaton	Reorder # 5360	Stopping bleeding from skin/muscle