从羊膜中提取Lumican及其储存温度的测定

摘要

本协议描述了从羊膜（AM）中提取lumican及其储存条件作为AM提取物（AME）在-20°C，4°C和室温（RT）下6，12，20和32天以量化其蛋白质和lumican浓度。

摘要

Lumican是人羊膜（AM）中一种富含亮氨酸的小蛋白聚糖，可促进角膜上皮化和胶原纤维的组织，保持角膜透明。本工作提出了一种从AM中提取蛋白质得到Lumican的方法。此外，还评估了在不同温度和时间段下储存的AM提取物（AME）中Lumican的稳定性。解冻100mgAM并机械去上皮化。将去上皮化的AM冷冻并粉碎，直至获得细粉，用2.5mL盐水缓冲液与蛋白酶抑制剂溶解并离心进行蛋白质提取。收集上清液并在-20°C、4°C和室温（RT）下保存6、12、20和32天。之后，在每个AME中量化Lumican。该技术允许从AM中提取lumican的可访问和可获取的方案。Lumican浓度受储存时间和温度条件的影响。Lumican在AME中在-20°C和4°C下储存12天明显高于其他AME。这种lumican提取可用于开发治疗方法和药物解决方案。需要进一步的研究来确定AME发光胶在再上皮化和伤口愈合过程中的用途。

引言

角膜影响最常用的治疗方法之一是羊膜移植;然而，近年来，出现了使用羊膜组织的各种成分作为替代和辅助治疗的新建议。在研究最多的AM成分中，是从AM提取物（AME^）中获得的成分1，²，^3，4，⁵，^6，7。AM含有多种可溶性因子，例如抗血管生成蛋白，白细胞介素（IL），金属蛋白酶（TIMP）的组织抑制剂，由TSG-6介导的抑制中性粒细胞细胞外陷阱的抗炎蛋白，生长因子:表皮生长因子（EGF），转化生长因子（TGF）（α和β），角质形成细胞生长因子（KGF），肝细胞生长因子（HGF）和Lumican，通过调节胶原纤维生成来维持角膜透明度1^，2，³，⁴，⁵，⁶，

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研究方案

所有实验程序均已获得机构审查委员会的批准（项目编号:CEI-2020/06/04）。AM是从瓦伦西亚孔德羊膜库（来自去识别的人类受试者）获得的，该数据库是按照Chávez-García等人的描述制备的¹⁷。

1.羊膜提取物的制备

1. 从羊膜库获取 100 毫克 AM。
   注意:根据之前的报告，50 毫克 AM 总共分泌 10 ng/mL 的卢米康¹⁴。为了获得更高浓度的lumican，请使用100mg的AM，相当于总面积为32cm²。
2. 如果AM被冷冻，请在室温下解冻。
   注意:在 II B 级层流罩下执行以下步骤。
3. 用10mL无菌平衡盐溶液（BSS，参见 材料表）在培养皿中洗涤AM2分钟。
   1. 将 BSS 倒入烧杯中。
   2. 重复步骤3并目视确认培养皿BSS中不存在甘油培养基。
      注:重复步骤 3。根据需要，直到培养皿BSS中不存在甘油培养基。
4. 将AM与10mL分散酶II（1.7IU / mL，参见 材料表）在37°C，5%CO₂ 下孵育30分钟。
   注意:分散酶II是一种中性蛋白酶，对上皮细胞具有....

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结果

结果报告为标准偏差 （SD） ±平均值。进行学生的 t检验和方差分析（方差分析）。 < 0.05 的 P 值被认为具有统计学意义。使用统计软件进行统计分析（见 材料表）。

AME中的总蛋白质量受时间和储存条件的影响。所有AME的基础蛋白浓度相似;总蛋白的范围为2.7±0.3μg/mL，评估的样品之间没有显着差异。然而，当样品储存12、20和32天时，观察到蛋白质浓?.......

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讨论

本研究分析了AME中Lumican的存在及其在不同储存条件下的稳定性的直接相关性。有趣的是，当AME中的总蛋白质浓度被量化时，储存后蛋白质浓度增加。有证据表明，有三种机制可以改变冷冻储存中的蛋白质浓度:冷变性、溶质的冷冻浓度和冰诱导的蛋白质结构部分展开¹⁹。由于样品中液相的结晶，冷冻过程可能会影响储存样品上的蛋白质浓度。结果表明，这可能是冷冻浓度的过程，.......

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 N H2SO4 stop solution	R&D Systems	DY994
100 μL micropipette	Eppendorf
1000 μL micropipette	Eppendorf
15 mm Petri dish	Symlaboratorios
18 G Needle (1.2 mm x 40 mm)	BD Becton Dickinson	305211
2 mL microcentrifuge tube	Eppendorf	Z606340
20 mL plastic syringe	BD Becton Dickinson	302562
20 μL micropipette	Eppendorf
20-200 μL micropipette	Eppendorf
5 mL microcentrifuge tube	Eppendorf	30119401
96-well microplate	SARSTEDT	821581
Aluminum foil	N/A	N/A
Amniotic membrane	Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank		100 mg
Balanced salt solution	Bausch + Lomb	BSS-403802
Beaker	N/A	N/A
BioRender	BioRender		figures design
Compact Rocker	BioRad	970822DD	Mod. 5202SD-BIO
complete, EDTA-free, Protease inhibitor cocktail tablets	Roche	11 873 580 001	Protease Inhibitor
Daiggner vortex Genie 2	A.Daigger & Co. , INC	22220A
Dispase II	Gibco	17105-041
ELISA plate spectrometer	Thermo Labsystems	35401106	Multiscan
Freezer
GraphPad Prism	GraphPad Software, Inc	version 9	statistical analysis and graphic program
Human lumican DuoSet ELISA kit	R&D Systems	DY2846-05	includes human Lumican capture antibody
Incubator	Forma Scientific	3326 S/N 36481-7002
Inverted light Microscope	Olympus	6A13921	to confirm de-epithelialization  Mod.CK2
Laminar flow hood	Forma Scientific	14753-567	Mod.1184
Liquid nitrogen	N/A	N/A
Mortar	N/A	N/A
Multi-channel pipettor	Eppendorf
Nitrogen Tank	Thermo Scientific		Mod. Biocan 20
Paper towels	N/A	N/A
Phosphate-buffered saline	R&D Systems	DY006
Pierce Modified Lowry Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23240
Plate sealers	R&D Systems	DY992
Reagent diluent	R&D Systems	DY995	1% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered
Refrigerated centrifuge	centurion scientific Ltd	15877	Mod. K2015R
Rubber policeman cell scraper	NEST	710001	for mechanical de-epithelialization
Scalpel knife	Braun	BB521	No. 10 or 21
Streptavidin-HRP 40-fold concentrated	R&D Systems	part 893975
Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solution	R&D Systems	DY999
Toothed tweezers	Invent Germany	6b	inox
Ultrapure water	PISA
Wash buffer	R&D Systems	WA126	0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4