肩突硬蜱人工膜喂养

摘要

这里介绍的是一种通过人工膜系统 在体外对 蜱虫进行血液喂养的方法，以允许各种蜱生命阶段的部分或完全充血。

摘要

蜱虫及其相关疾病由于其公共卫生和兽医负担而是一个重要的研究课题。然而，在研究和饲养过程中对蜱虫的喂养要求可能会限制实验问题或实验室研究蜱虫及其相关病原体的能力。人工膜饲喂系统可以减少这些问题，并开辟传统动物饲喂系统可能无法实现的新研究途径。本研究描述了一种人工膜喂养系统，该系统已经过改进，可在所有 肩突硬蜱 生命阶段成功进食和肿胀。此外，本研究中描述的人工膜喂养系统可以通过简单细化所需的膜厚度来修改以用于其他蜱虫物种。人工膜饲喂系统的好处被系统的劳动密集型、可能影响饲喂成功的其他环境因素以及针对蜱虫的每个新物种和生命阶段改进技术的需求所抵消。

引言

蜱传疾病严重影响着全世界人类和动物的健康，2004年至2016年占美国所有病媒相关疾病的三分之二以上^1。此外，近年来病例数一直在增长，越来越多的人和牲畜受到蜱虫及其相关疾病的影响^2，3。虽然病例数上升趋势的原因可能有很多，但气候变化是一个重要因素^3，4.预计蜱传疾病病例数量的持续增加突出表明需要开发新工具来调查蜱与其传播的病原体之间的关系。

众所周知，蜱在进食过程中会经历生理和基因表达的变化，这些变化在病原体传播中起作用^5，6。使用动物模型进行研究检查全部和部分摄食对病原体传播和获取的影响可能很困难，特别是在啮齿动物模型不易被特定病原体感染的情况下。例如， 无形体吞噬细胞变体 -1菌株在 肩突硬蜱 和鹿之间自然传播，但无法感染小鼠，使实验室中的蜱感染复杂化^7。人工喂养系统也可以通过使用具有抑制传播或感染的基因缺失的转基因突变体 来帮助研究伯氏疏螺旋体 等病原体

研究方案

1. 准备蜱膜室

1. 用70%乙醇擦拭，准备一个平坦的无孔表面，例如玻璃平面或陶瓷涂层的金属底座，然后用单层保鲜膜覆盖，确保保鲜膜平坦，没有气泡或皱纹（见 图1A）。
2. 将100%人造丝镜头清洁纸胶带到准备好的表面上。确保它平坦并用胶带在纸张的所有四个面上略微拉紧。可以使用步骤 1.3 中描述的体积将两张 4 英寸 x 6 英寸的透镜纸制成膜。
   注意：这足以组成多达 12 个进料室（见 图 1B）。如果膜用于幼虫蜱，请使用云龙纸代替镜头清洁纸。
3. 通过将硅胶套件的每个部分的 5 mL 量出到一次性容器中，在加入 1.5 mL 己烷之前轻轻混合两种液体来制备 00-10 硬度的硅胶混合物。继续混合，直到混合物均匀并充分混合。
   注意：如果为成虫制作膜，请使用硬度为00-50的硅胶。
4. 使用小刮刀将硅胶混合物分布在镜头纸上。静置1分钟，以确保硅胶已浸入镜头纸中。使用少量向下压力用刮刀稳定地将多余的硅胶刮到侧面。用刮刀进行第二次通过，不施加向下的压力，以去除任何硅胶线并产生光滑的层。
   注意：该过程的这一步可能需要一些练习才能为每个生命阶段生产最佳厚度的膜（成人：150-200μm;若虫：90-120μm;幼虫：80-100μm）。较厚的膜（在生命阶段的进料公差范围内）通常可以通过减少腔室中的冷凝和改善....

结果

成功的喂养取决于是否需要部分或完全充血。成功喂养的 肩胛骨I. 在成虫中变成青铜灰色，并自行从膜上分离。但是，如果它们至少是豌豆大小的，则在完成喂食时，它们可能会从膜上分离。对于 肩蜛不成熟 阶段，完全充血的蜱的大小各不相同，并且由于与成虫不同，它们不会表现出颜色变化，因此脱离是确定蜱是否完全充血的最佳方法。参见 图3 ，了解若?.......

讨论

蜱虫的人工膜喂养为各种实验程序提供了有用的工具，但不太可能取代所有应用的动物喂养。在没有动物喂养的情况下，在所有生命阶段维持大量蜱虫通常是站不住脚的。相反，人工饲喂系统对于其他目的很有价值，例如用模型宿主不支持的病原体感染蜱虫，在简化的摄食环境中评估化合物或微生物的受控剂量对蜱虫的影响，或饲养依赖实验室中不易获得的宿主动物的小蜱虫菌落⁸

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
00-10 Hardness Silicone	Smooth-On	Ecoflex 00-10	Trial size from Smooth-On Store
00-50 Hardness Silicone	Smooth-On	Ecoflex 00-50	Trial size from Smooth-On Store
30 Hardness Silicone	Smooth-On	Mold Star 30	Trial size from Smooth-On Store
6-well cell culture plates	Corning Incorporated	3516
Adenosine triphosphate (ATP)	Millipore Sigma	A1852-1VL	Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter
Bovine blood	HemoStat	DBB500	Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment
Clingwrap	Fisherbrand	22-305654
Filter Paper	Fisherbrand	09-790-2C	Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too
Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene)	Bioquip	2871	Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml
Glucose	Millipore Sigma	G8270-100G
Hexane	Millipore Sigma	139386-100ML
Lens paper	Fisherbrand	11-995	100% rayon
Nystatin	Gold Biotechnology	N-750-10
Parafilm	Fisherbrand	S37440
Penicillin/streptomycin/fungizone	Gibco	15240-096	Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Amphotericin B)
Phagostimulant	Made in House		Collected from prior tick feeds
Polycarbonate Pipe	McMaster-Carr	8585K204	Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel.
Rubber O-rings	McMaster-Carr	9452K38	5 mm thick, 1.25 inch inner diameter
Soft touch forceps	VWR	470315-238
Super glue			cyanoacrylate glue
Unryu paper	Art supply stores		mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA