用于原 位 测量活组织辐射度的组织内辐射微探头

摘要

本文描述了一种原 位 测量活组织中辐射度的方法。这项工作包括用于不同辐射度和辐照度测量的微尺度探针的构造细节，为安装组织以表征辐射度提供了指导，并概述了分析结果数据的计算方法。

摘要

生物体看起来不透明，主要是因为它们的外组织层对入射光强烈散射;强吸收性颜料（如血液）通常具有较窄的吸光度，因此吸光度峰外的平均光程可能很长。由于人们无法看穿组织，他们通常认为大脑、脂肪和骨骼等组织很少或没有光。然而，光响应性视蛋白在许多这些组织中表达，并且对其功能知之甚少。组织内部的辐射对于理解光合作用也很重要。例如，巨蛤具有很强的吸收能力，但在组织深处保持着密集的藻类种群。光通过沉积物和生物膜等系统传播可能很复杂，这些群落可能是生态系统生产力的主要贡献者。因此，已经开发了一种构建光学微探针的方法，用于测量标量辐照度（光子通量与点相交）和辐照度（光子通量垂直穿过平面），以更好地了解活组织内的这些现象。这种技术在现场实验室中也是可以处理的。这些微型探头由热拉光纤制成，然后将其固定在拉式玻璃移液器中。为了改变探头的角度接受度，然后将一个10-100μm大小的紫外光固化环氧树脂球与二氧化钛混合固定在拉动，修剪的纤维的末端。将探针插入活组织中，并使用显微操纵器控制其位置。这些探针能够以10-100μm的空间分辨率或单细胞规模测量原 位 组织辐射。这些探针用于表征到达活小鼠皮肤下方4毫米的脂肪和脑细胞的光，并表征在富含藻类的活巨蛤组织内到达相似深度的光。

引言

令人惊讶的是，陆地动物和浅海居民体内有足够的光进行视觉生理甚至光合作用。例如，小鼠头部中心（在强血红蛋白吸光带之外）的光照水平相对于外部世界衰减了三到四个数量级。这大致是室内和室外光线水平之间的差异。因此，由于强散射引起的组织或材料的不透明度与由于强光吸收引起的不透明度不同。光可以在强前向散射系统中保持长距离传播，类似于光在具有高浓度细胞^{和粒子的水}生系统中传播1。鉴于视蛋白在所有动物的所有组织中几乎普遍表达，这一观察结果尤其突出。因此，了解光在活组织中如何以及在何处衰减和散射非常重要。然而，与水生系统不同，具有活组织，不可能将仪器浸入水柱中获得辐射度和辐照度测量值，因此需要一种新技术。

以前用于表征活组织的吸收和散射特性的其他方法包括测量组织反射探头和/或积分球²，³，显微镜方法，例如扫描共聚焦显微镜⁴，测量激光^{在表面上的}扩散5，以及建模技术^，例如蒙特卡罗辐射转移⁶.提到的实验方法通常需要特定的、大型的、昂贵的设备或关于组织结构的详细知识，并且通常它们表征组织深处光的空间结构的能力有限。

也有类似的基于探针的方法，使用皮下注射针将光纤插入组织⁷，^8，9。根据我们的经验，改良针在穿刺组织方面是有效的，但需要相当大的力量，并且在通过密集堆积的细胞时通常会撕裂脆弱的组织。因此，这些针通常需要外科手术才能将超过一毫米左右插入组织层。这里描述的方法，使用润滑的，拉动的玻璃支架，能够在细胞之间滑动，对组织的伤害最小，并且无需额外的手术。

这份手稿介绍了一种受乔根森及其同事测量藻垫¹⁰，¹¹ 内光的工作启发的方法^，使用玻璃支持的光学微探针和便携式电子设备，这些电子设备适合深入探测致密组织并在现场构建和使用。这些探针可以构建为以高空间分辨率表征活组织内的标量辐照度（从各个方向照射到一个点的光）和辐射度（光与水平面相交）。这些探针最初是为了测量光共生巨蛤¹²组织内的辐射转移而开发的。整个组织吸收和传输的标准测量不足以表征组织的光合作用性能，因为所有入射光是否被组织表面经历高强度的少数细胞吸收或许多细胞在整个组织体积中经历低强度，都会有很大的不同。在第二个项目中，这些探针用于测量小鼠大脑内的体内辐照度¹³，^14，从而表征大脑深处表达的视蛋白的光环境。这些微探针既小又灵敏，足以测量小鼠脑组织内的辐照度，所有皮毛、皮肤和骨骼都完好无损，并证明生理光水平很容易高到足以刺激深部脑视蛋白。

这种微光学探针和测量装置对于需要量化和表征生物组织内部光的研究人员非常有用，特别是对于更细致入微地了解光合作用或眼睛外表达的视觉色素的功能。该方法可以单独使用或与其他技术结合使用，以低成本充分表征活组织内的光学特性和光传播，使用内部内置的小型便携式设备并具有与任务相关的可调参数。

研究方案

本研究符合耶鲁大学关于脊椎动物和无脊椎动物研究的所有相关伦理规定。

1. 构建光学微探针

1. 构建玻璃套管，材料:巴斯德移液器，5.75 英寸（见 材料表）
   1. 使用可安装的鳄鱼夹（材料表），将玻璃移液器安装在宽端，使锥形端朝下朝向地板，并且移液器的方向垂直于地板。
   2. 将 50 g 塑料副手柄（材料表）悬挂在移液器的锥形端。在移液器和虎钳夹具之间放置一垫电工胶带，以帮助防止打滑。
   3. 使用小丁烷炬加热移液器的锥形端（材料表）。将火焰施加在虎钳手柄上方 1 厘米处。握住火炬，使火焰最亮的部分距离玻璃3厘米，玻璃位于火焰的尖端。当移液器的长度增加约 5 英寸时，立即取出火焰。
   4. 使用小剪刀或玻璃切割器修剪移液器的拉端，新拉动直径大约是下一节中使用的光纤的两倍（参见步骤1.2）。使用碳化硅纸（材料表）锉下修剪端的任何尖锐区域。使用喷出的异丙醇瓶冲洗掉任何产生的小玻璃碎片或灰尘，然后用压缩空气冲洗掉。
2. 拉动光纤（图1D）
   1. 使用剃须刀片切断光纤，移除直径为 200 μm 的 SMA 端接光纤的一个 SMA 连接器（材料表）。切近其中一个 SMA 端接。然后，使用剃须刀片取下接下来 5 厘米的塑料和玻璃纤维护套，使裸露的光纤暴露并从完整组件的其余部分突出。
   2. 使用丁烷火炬烧掉玻璃纤维上的聚酰亚胺聚合物涂层。用异丙醇冲洗。使用不起毛的湿巾将裸露的玻璃纤维擦拭干净。
   3. 下一步是安装裸光纤，以便也可以用火焰拉动它。将光纤的裸端直接安装在桌子或搁板边缘的钳夹（材料表）中，让光纤的SMA端向地板悬挂。在光纤的夹套端添加两个小夹具（总重量:10 g）形式的拉动砝码，距离裸光纤固定在钳夹中的位置约 12 英寸。
   4. 要拉动光纤，请从丁烷火炬火焰开始。在火焰开启的情况下，将丁烷割炬与裸光纤垂直 1 厘米，从钳夹固定裸光纤的位置垂直向下 3 厘米。让纤维拉伸、拉动、分离并掉落到地板上。
   5. 检查由此产生的拉动光纤端。用碳化硅纸轻轻打磨掉任何不规则之处，用异丙醇和无绒湿巾清洁，并用压缩空气干燥。
      注意:此时，可以使用显微镜来表征和记录拉纤维的大小和形状。
   6. 使用薄膜不透明的笔使光纤的侧面变暗并防止杂散光进入（材料表）。轻轻地将纤维拉过笔尖，只留下笔尖的一小块区域。
3. 将拉动的纤维安装在玻璃移液器套筒内（图1A）
   1. 在体视显微镜下工作，小心地将步骤1.2中的锥形光纤插入步骤1.1中改变的玻璃移液器的宽端，并将光纤推入，直到~1毫米的裸光纤从移液器的锥形端伸出。
   2. 使用电工胶带将光纤的夹套端固定到移液器的宽端。
   3. 将一滴氰基丙烯酸酯粘合剂滴在小针上（材料表）。小心地将粘合剂滴接触拉移液器的切割边缘，避免拉动纤维的裸露端。
   4. 允许毛细管作用将粘合剂吸入移液器中，润湿移液器壁和光纤之间的区域。在移动探头组件之前，让粘合剂固化至少 15 分钟。
4. 用散射球修改光纤尖端（图1C）
   1. 通过将一滴紫外光固化粘合剂与二氧化钛粉末以~1:1 v/v混合（材料表）来创建散射球尖端的原料。
   2. 将探头连接到带有安装杆支架（材料表）的显微操纵器上，使探头处于水平方向。通过将电线或针的尖端浸入上面制备的粘合剂/_{TiO 2} 混合物中，以形成粘合剂液滴来制备散射材料的工作储液器。将带有液滴的电线或针头安装在水平探头尖端附近。使用安装在工作台上的鳄鱼夹可以方便地做到这一点。
   3. 在探头尖端沉积一个散射球。使用显微操纵器缓慢而小心地将探头光纤的尖端推入粘合剂/TiO₂ 的液滴中。然后，快速从胶水中取出尖端。重复两到三次，直到所需尺寸的球形粘合剂液滴沉积在光纤的尖端。
      注意:散射球的直径是锥形光纤直径的两到八倍，将保持稳定。最终的最佳尺寸取决于最终所需的应用。
   4. 通过将光纤的SMA端端连接到光纤耦合的UV光源来固化球体（材料表）。
      注意:本研究中使用的光源功率为5.3 mW。在此功率下，推荐的固化时间至少为12小时或过夜。固化后是表征和测量最终光学探针尖端尺寸的好时机。

2.准备和安装用于光学测量的组织（图2和图3）

1. 准备培养皿以安装样品以进行实验。使用丁烷炬加热巴斯德移液管的大端，打孔以熔化 35 mm x 10 mm 塑料培养皿底部直径为 0.5 cm 的孔。用电工胶带或实验室胶带密封培养皿底部的孔。一次制作几个以提高效率。
2. 根据包装上的说明准备液体明胶（材料表）。
   注意:来自杂货店的商业食品级无味明胶比化学供应商的化学级明胶更好，因为化学级明胶的光学透明度和机械可靠性低于食品。
3. 对要使用的组织进行解剖和制备。
   注意:根据经验，任何厚度达1厘米的扁平组织都可以在本实验中使用适合感兴趣系统的任何解剖技术成功测量。对于巨蛤组织，使用8毫米活检冲头制作一个扁平，规则的蛤蜊组织圆圈，用于实验¹²。对于该系统，考虑到完成测量所需的时间长度，一次只能有效地制备一个样品，以确保样品在实验结束时仍处于逼真的状态。
4. 用液体明胶填充步骤2.1中的两个培养皿四分之一，并冷却至室温（RT）刚好凝胶化。在一个培养皿中，将活检放在培养皿底部孔中形成的粘性明胶垫中。使用巴斯德移液管在活检周围轻轻添加RT明胶，直到培养皿充满（图3）。用明胶填充第二个培养皿以制作空白样品。
5. 将样品盘放入冰箱约10-30分钟，直到明胶完全固化并且触感略有弹性。
   注意:在凉爽的房间中，这可能不是必需的;在热带地区工作时，需要此步骤才能完全固化明胶。
6. 在显微操纵器上为培养皿制作支架（图2）
   1. 在厚有机玻璃中切割一个 6 厘米 x 6 厘米的 1/4 正方形（材料表）。
   2. 在塑料方块上钻孔或熔化一个与培养皿直径相同的孔（~35毫米）。确保培养皿紧贴在此孔中，并通过摩擦固定到位。在培养皿的边缘添加胶带以略微增加尺寸和摩擦接触。
   3. 在塑料正方形的角落钻或熔化一个直径为 1/4 的孔。使用此孔使用 1/4 英寸螺钉和螺栓将正方形连接到显微操纵器上。
   4. 用黑色电工胶带覆盖塑料方块，以减少到达探头的杂散光。同样，使用胶带在方形的两侧周围创建一个裙边，延伸到插入的盘子底部下方（>10 mm），以减少杂散光（图2B）。
   5. 使用螺栓和适当的硬件将培养皿支架连接到显微操纵器上，该显微操纵器允许在大于样品厚度的范围内进行三维调整和分辨率良好的垂直运动（ 材料表中 提到的机械手的第 1 部分和第 2 部分就是很好的例子）。将此显微操纵器固定在光学试验板上。

3. 组织活检的测量设置

1. 在进行测量的区域上方安装光源，以便在光线到达放置样品的平面时准直（图2A）。例如，将 5 cm 准直透镜（材料表）连接到 5 mm 液体光导（材料表），并使用连接到光学试验板的台虎钳和框架将样品上方升高 >0.6 m（材料表）。然后，将光导连接到宽带光源，例如材料表中列出的等离子光源。
2. 将探头连接到垂直方向的支架上，使其指向光源。用夹子、软管夹或胶带将探头固定在光学台柱上。
   注意:在巨蛤实验中，使用专门设计的杆支架，例如 材料表中列出的显微操纵器。在这项工作中，它通过磁铁固定在光学试验板上（材料表）。通过将探头和样品同时放在机械手上获得的额外对准自由度很方便，但不是必需的。小心不要过度夹在柱子上，因为这会破坏移液器外壳。
3. 将样品操纵器放置在垂直安装的探头附近。使用样品操纵器调整样品台的位置，使探针在培养皿底部的0.5cm开口中居中。请格外小心，避免接触或碰撞已安装探头的尖端。
   注意:安装在样品区域上方的吊杆式体视显微镜可能很有用。这样，可以在开始实验之前查看探针尖端、载物台和样品的自上而下的对齐情况（图2A）。
4. 将探头光纤的SMA端接端连接到USB光纤光谱仪（材料表），并使用USB电缆将光谱仪连接到计算机。

4. 数据收集

1. 实验设置
   1. 使探头和操纵器处于收集数据的精确对齐位置，如步骤 3.4 所示。
   2. 使用棉签或细针小心地将少量硅润滑剂（材料表）涂抹在将插入组织的探针部分，以降低探针两侧与组织样品之间的摩擦。在每次基线或组织测量之前重新涂抹硅润滑剂。
   3. 取下覆盖空白样品培养皿孔的胶带，并将其放入样品架（步骤2.7），确保通过摩擦将其牢固地固定到位。
   4. 使用显微操纵器将样品降低到探针上。让探针通过培养皿底部的孔 进入 明胶。继续直到探头距离明胶层底部约 5 mm。
   5. 打开光源。使用光谱仪软件，调整光谱仪积分时间，直到信号尽可能高但不饱和。将平均扫描次数设置为 2 到 5，平滑像素值设置为 6。对于此基线，此阶段的可用积分时间可能在 1-50 毫秒之间变化。
2. 收集参考光谱
   1. 收集深色测量值。
      1. 使用空白样品设置光谱仪参数后，将探针光纤从光谱仪上拆下，并用光谱仪随附的不透明金属盖覆盖端口。
      2. 从光谱仪获得暗测量值（通常使用GUI中的暗灯泡图标），以表征无输入光的光谱仪的噪声。根据数据采集策略保存此测量值。
   2. 收集灯测量值。将探针光纤重新连接到光谱仪，等待信号稳定，然后获取另一个频谱。该测量表征在没有组织的情况下通过明胶到达探头的光。
3. 收集组织光谱
   1. 取下样品培养皿底部的胶带，并将其放入样品架中。
   2. 使用三维操作将样品培养皿与探针对齐，使组织活检位于探针尖端上方的中心。
   3. 将硅凝胶涂在探针上（见4.1.2），然后将样品缓慢降低到探针上，直到探针尖端穿过支撑组织样品的明胶并刚刚进入组织样品。
      注意:某些光谱仪和计算机程序允许实时监控检测到的光。使用它来确定探针何时进入组织。一旦探针尖端与组织直接接触，光谱强度就会突然降低。
   4. 通过确保测量的频谱既不会太嘈杂也不会饱和，验证积分时间是否适合测量。如有必要，更改积分时间。
      1. 每当调整积分时间时，执行并存储新的暗测量（步骤4.2.1）。不要更改平均扫描次数或平滑像素数。
      2. 找到合适的测量参数后，进行测量并保存光谱。
   5. 使用显微操纵器将样品向下移动指定距离。对于用于本研究的机械手，每个小刻度线为0.001英寸或25.4微米。每次测量时，样品向下移动五个刻度线或127μm。重复步骤 4.3.4。
   6. 继续保存组织内每个垂直位置的光谱。
      注意:对于此处描述的系统，单个组织样品内测量所需的积分时间在1 ms至5 s之间变化。最终，探针尖端将离开组织顶部并在那里可见（图4A）。这是最终测量值，表征组织顶部入射的光。
4. 加载和处理数据
   1. 使用光谱仪的软件将所有收集的光谱（暗光谱、灯光谱和组织测量值）转换为分隔的文本文件。
   2. 使用 Matlab 或所选的编码语言，加载样品的所有测量文件。对于每个组织测量光谱，用匹配的积分时间减去暗光谱，然后除以积分时间。
      注意:在本研究中，使用Matlab脚本来加载和处理数据（补充文件1）。
   3. 通过将探针在组织内获得的光谱除以在空明胶中获得的基线光谱，计算到达组织中每个位置的入射光的百分比。
      注意:组织顶部的测量值（步骤4.3.6）应与明胶中的基线测量值（步骤4.1）非常相似，并且在分割时应接近100%。根据实验环境，可以使用灯光谱（来自空明胶的光谱或来自组织最顶部的光谱）作为参考。然而，在开始实验之前收集灯光谱仍然很重要。这是因为，如果探针破裂或实验在到达组织顶部之前失败，则在失效之前获得的数据仍然可用，如果没有相应的初始灯参考光谱，则情况并非如此。
   4. 可视化数据;等值线图可能会有所帮助（图4B）。

结果

该协议描述了构建微光学探针的过程，该探针可用于测量辐照度（从一个方向到达点的光），或者，添加光散射球形尖端，以测量标量辐照度（从各个方向到达点的光）。这些探针可以在接近活组织内单个细胞长度尺度的空间分辨率下测量辐照度。该协议还描述了使用所述探针制备用于辐照度测量的组织样品的代表性方法以及用于数据查看和分析的代表性方法。

讨论

该协议描述了一种通过大量活组织系统表征光学环境的技术，其空间分辨率大约在单细胞的规模上。这种廉价、灵活且易于现场处理的方法可能对任何研究光在生命系统中传播的研究人员有用。根据经验，与现有方法⁷相比，这些探针需要更多的练习和技能来构建，但导致更少的组织损伤和更全面地表征更大体积致密组织的能力。

该方法包括四个部分。第一?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1" travel ball bearing center+D11+A2:D31+A2:A2:D31	Edmond Optics	37-935	Part 2 of manipulator for lowering sample
1/4" thick acrylic sheet	McMaster-Carr	8505K754	For making Petri dish holder
3/4" mini spring clamp	Anvil	99693	Use as weight for pulling optical fiber
8 mm biopsy punch	Fisher Scientific	NC9324386	For tissue sample
Butane Torch	McMaster-Carr	MT-51	Heat source for pulling fiber and pipette
Collimating lens	Thorlabs	LLG5A1-A	To collimate light source through liquid light guide
Compressed air	McMaster-Carr	7437K35	For drying pulled fiber and pipette
Cyanoacrylate glue - liquid	McMaster-Carr	66635A31	For securing tapered fiber end at top of pulled pipette
Electrical tape	McMaster-Carr	76455A21	For securing fiber in pipette and for adding grip to clamps
Fine grade carborundum paper	McMaster-Carr	4649A24	Small triangle on exacto knife holder works well
Gelatin	Knox	10043000048679	For securing the tissue biopsy in the petri dish
Glass Pasteur Pipete	Fisher Scientific	13-678-20B	Disposable glass pipette 5.75" in length
Insulin syringes, 31G needle	BD	320440	For applying glue
Isopropanol	McMaster-Carr	54845T42	For cleaning pulled fiber and pipette
Kimwipe	Cole-Parmer	SKU 33670-04	For wiping optical fiber and glass pipette clean
LED driver	Thorlabs	LEDD1B	For powering the UV LEDs
Light source for measurements	Cole-Parmer	UX-78905-05	Low heat white light source for measurements
Linear metric X-Y-Z axis rack and pinion stage	Edmond Optics	55-023	Part 1 of manipulator for lowering sample
Liquid light guide	Thorlabs	LLG5-4T	For light source in measurements
Magnetic feet	Siskiyou	MGB 8-32	For use with magnetic strips
Magnetic strips	Siskiyou	MS-6.0	For mounting magnetically to breadboard
Manipulator #1	Siskiyou	MX10R	4-axis manipulator with pipette holder
Opaquer pen, small	WindowTint	TOP01	For opaquing side of optical fiber to prevent stray light from enter probe
Optical breadboard	Edmond Optics	03-640	For stable affixation of probe holder, sample, microscope and light source
Optical fibers	Ocean Optics	P-100-2-UV-VIS	About 4 fibers are good to have
Plasma light source	Thorlabs	HPLS345	For tissue radiometry measurements
Plastic plier clamp	McMaster-Carr	5070A11	Plier clamp used for weight in pulling pipette
Polystyrene Petri dishes	Thomas scientific	3488N10	Sample holders, enough volume to hold sample thickness plus ~10 mm of gelatin on top
Razor blades	McMaster-Carr	3962A3	For stripping jacketing from optical fiber
Silicone oil lubricant	Thomas scientific	1232E30	For reducing friction between probe and tissue
Software for analyzing data	Matlab		Chosen software for data analysis
Spectrometer + spectrometer software	Avantes	AvaSpec-2048L	Spectrometer can be any brand, this one is compatible with sma-terminated optical fibers and comes with its own software for running the spectrometer
Titanium dioxide powder	Sigma Aldrich	718467-100G	For making scattering sphere
Toolour tabletop clip	Toolour	Toolour0004	For holding pipette while pulling and for holding finished probes
Trigger-action bar clamps	mcMaster-Carr	51755A2	Good for holding optical fibers while pulling or curing
UV curable adhesive	Delo Photobond	GB368	For making scattering sphere
UV light source	Thorlabs	M365FP1	Light source for curing adhesive in scattering ball, this one is sma-fiber compatible, higher intensity = less cure time
White LED light source	Thorlabs	MCWHF2	For characterizing pulled fiber and scattering sphere