藏药红景天颗粒中多指标组分的 体外 溶出度测定

摘要

在这里，我们在 体外测试了红景天颗粒（RG）的溶解度，绘制了红景天苷，没食子酸和没食子酸乙酯在超纯水中的溶解曲线，并将曲线拟合到不同的数学模型中。该协议为RG的 体内 生物等效性和体内外体 外 相关性研究提供了信息和指导。

摘要

藏药红景天颗粒（RG）成分复杂，RG的整体质量难以确定。因此，建立一种测定RG多组分 体外 溶出度的方法对质量控制具有重要意义。本研究采用中国药典（2020年版）第四通则0931的第二桨法，符合美国药典（USP）的器具2。将溶解装置设置为100 rpm的转速，以超纯水为溶解介质。在每个时间点收集1 mL的样品体积。采用高效液相色谱法测定没食子酸、红景天苷和没食子酸乙酯在不同时间点的累积溶出量。最后，绘制了溶解曲线，并将曲线拟合到GompertzMod，Gompertz，Logistic和Weibull方程。结果表明:没食子酸在RG中的累积溶出度在1 min时大于80%，红景天苷和没食子酸乙基在5 min时的累积溶出度超过65%，30 min后各指标组分的累积溶出度下降。曲线拟合表明，GompertzMod方程是RG每个指数分量的最佳拟合模型。总之，本协议中描述的溶出度测试方法简单，准确且可靠。它可以表征RG中指标组分的体 外溶出行为，为RG的质量控制和其他民族化合物的质量评价提供方法学参考。

引言

在中国，心血管疾病患病率持续上升，心血管疾病发病率和死亡率居^{中国居民首位}1。冠心病的心绞痛是由冠状动脉粥样硬化引起的管腔狭窄引起的，导致冠状动脉血液供应相对不足和心肌缺血缺氧^2。近年来，中医药治疗冠心病的疗效得到了^{众多医生的}认可3。

中医药在缓解临床症状和提高患者生活质量方面发挥着重要作用⁴.红景天颗粒（RG）是从青藏高原药用植物红 景天L 中提取和精制的。RG的主要成分是红景天苷、红景天和类黄酮^5，6。RG具有补气⁷ ，活化和促进血液循环缓解疼痛的作用。临床上用于治疗气虚血瘀引起的胸梗阻、冠心病、心绞痛⁸.仅含量测定并不能完全反映药物的内在质量，因为 体外崩 解和溶出都会影响药物的生物利用度和功效^9，10。中药溶出的检验方法有旋转篮法、桨法、小杯法等。旋转篮法的缺点是旋转过程中只有旋转篮的外部与溶解介质接触，这并不能反映现实世界的溶解行为。桨法可以克服上述缺点，使其比篮子法更适合一些固体中药制剂¹¹。目前尚无RG体 外 溶出分析的报道。为了更全面地控制RG的质量，研究了RG中3种指标成分（没食子酸、红景天苷和没食子酸乙酯）的溶出行为。本研究为RG的质量控制提供了数据，为其他民族化合物制剂的质量评价提供了方法学参考。

研究方案

1. 溶液制备

1. 制备对照物质储备溶液:在电子分析天平上分别称取10.6 mg红景天苷、5.24 mg没食子酸和5.21 mg没食子酸乙酯，并将它们单独加入5 mL容量瓶中。然后，加入HPLC级甲醇溶解并稀释至5 mL。最后摇匀，得到质量浓度分别为2.120 mg/mL、1.048 mg/mL和1.042 mg/mL的对照品储备溶液。
   注意:对照物质储备溶液含有2.120 mg / mL红景天苷，1.048 mg / mL没食子酸和1.042mg / mL没食子酸乙酯作为随后标准曲线中每种溶液的储备溶液。
2. 准备测试样品溶液。使用超声波清洁机（功率:200 W，频率:40 kHz）提取 2.8 g RG（材料表）和 10 mL HPLC 级甲醇 30 分钟，然后用 0.22 μm 过滤器过滤以进行系统适应性测试。
3. 制备含有0.590 mg/mL红景天苷、2.030 mg/mL没食子酸和1.930 mg/mL没食子酸乙酯的混合参比溶液。
   注意:将每种标准品（2.950 mg红景天苷，10.150 mg没食子酸和9.650 mg乙基没食子酸）溶解在HPLC级甲醇中的5 mL容量瓶中作为溶解介质。
4. 获得RG各特征组分的理论含量，用于超纯水提取。
   1. 将 2.8 g RG 放入 500 mL 锥形烧瓶中，加入 200 mL 超纯水，超声提取（功率:200 W，频率:40 kHz）60 分钟。然后，用0.22μm过滤器过滤。
   2. 根据以下实验中获得的线性方程确定供试品溶液的含量。

2. 色谱条件

1. 如 表1 所示设置色谱条件，以进行高效液相色谱。有关所用仪器的详细信息，请参阅 材料表。

3. 系统适应性测试

1. 研究线性关系。
   1. 将没食子酸和没食子酸乙酯对照储备溶液稀释5倍、10倍、25倍、50倍、125倍，将红景天苷对照储备溶液稀释2倍、4倍、8倍、16倍、32倍，即得绘制标准曲线的梯度浓缩溶液。
      注意:根据样品处理的初步实验调整标准曲线的稀释比例。在初步实验中，先稀释3种标准品的储备溶液5倍、10倍、25倍、50倍和125倍，然后绘制第一条标准曲线。然而，当检测到测试样品的浓度时，发现红景天苷的浓度不在该标准曲线的线性范围内，因此，调整浓度以将它们包含在曲线中。综上所述，利用上述初步实验确定三种测试样品的最终稀释浓度，用于后续实验研究。
2. 精密检测:将 10 μL 混合参比溶液注入 HPLC 系统，每日 6 次，并以步骤 2.1 中所述的相同 HPLC 条件运行样品。记录每个特征分量的峰面积。
3. 稳定性测试实验:分别在0 h、6 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h和24 h后，注入10 μL制备的样品溶液，并根据色谱条件测定HPLC的峰面积。
   注意:峰面积由HPLC系统自动记录。
4. 重现性测试:取同批RG的6个样品，按步骤1.2中的方法制备供试样品溶液。将每个样品 10 μL 注入 HPLC 系统。按照步骤2.1中所述运行样品并确定重现性。
   注意:通过比较六个样品之间的浓度差异来评估重复性。
5. 恢复实验
   1. 为测试溶液准备同一批次RG的六份。然后，在供试品溶液中加入各指标组分的对照品约50%，以计算回收率。在HPLC系统中以步骤2.1中所述的相同条件运行这些样品。
   2. 计算恢复率。
      注:回收率=（C-A）/B x 100，其中A为供试品溶液中待测组分的量，B为对照品的添加量，C为含有对照品和RG样品的溶液的测定值。有关执行上述步骤的色谱条件，请参阅步骤2.1（即步骤3.1-3.5）。

4. 体外 溶出度试验

1. 使用中国药典（2020年版）通则0931第二种方法的桨法进行溶出度试验¹²。
   注:取样技术和设备:药物溶出装置（材料表）具有溶出度杯，桨，温度控制系统和速度调节系统。在开始溶解实验之前，将水预热到设定的温度，然后设定相应的速度。添加RG后立即开始记录时间。
2. 向药物溶出装置的溶出杯中加入100mL超纯水，并保持温度在37°C±0.5°C。 将转速设置为 100 rpm。
   注意:溶解装置有一个加热装置，允许在系统内设置温度。红景天苷在水中的溶解速率无显著差异，人工胃液（16.4 mL稀盐酸[234 mL浓盐酸用水稀释至1000 mL]与约800 mL水和10 g胃蛋白酶，摇匀，用水稀释至1，000 mL）和人工肠液（含胰蛋白酶的磷酸盐缓冲液[pH 6.8]）¹³。选择最容易获得的水（超纯水）作为溶解介质。
3. 将2.8gRG加入溶出杯中，并立即开始记录溶出持续时间。用进样器（参见 材料表）在 1 分钟、5 分钟、10 分钟、20 分钟、30 分钟和 60 分钟收集总共 1 mL 的样品，并立即在相同温度下用溶解介质补足溶出杯中的体积。
   注意:溶出杯中的采样管无法收集小体积的样品，因此使用进样器收集样品。必须快速采集样本，以免错过指定的采集时间点。
4. 立即通过0.22μm微孔膜过滤收集的样品，并取后续滤液。通过HPLC确定每个时间点每种组分的含量（按步骤2.1）并计算累积溶解度。
   1. 要计算累积溶出度，请计算每个时间点的溶出度（X_n）:
      X_n = A / B x 100，其中A是每个时间点测量的成分数量，B是每个组件的理论含量。
   2. 然后，计算累积溶解度（Y）:
      Y = X n + （X 1 + ... + X _n-1） x V 2 / V 1，其中V₁是溶出介质的总体积，V ₂是每次采样后加入的溶质体积。
      注意:由于色谱图中红景天苷和没食子酸的响应值较低，因此在溶出曲线中未绘制1分钟时间点红景天苷和没食子酸乙酯的累积溶出度。

5. 拟合溶出度模型

1. 将每个时间点的累积溶出度数据导入数据分析软件。
2. 使用数据分析软件中的药物溶出度分析插件拟合龚珀茨模组、龚珀茨方程、逻辑方程和威布尔方程¹⁴。 R² 的值越大，曲线拟合效果越好。
   1. 启动软件，选择 Book1 窗口进入 原始数据编辑 窗口。
   2. 在第一列 A（X）-Long Name 中输入时间，将时间定义为时间，并输入每个溶出度测定时间。在第二列B（Y）-Long Name中输入数据，将数据定义为累积溶出度，输入每个溶出度测定时间的累计溶出度百分比。
   3. 数据输入后，选择A（ X ）和 B（Y）列，然后在软件菜单栏中选择 药物溶出分析 插件，然后单击 拟合溶出度数据>连接拟合>确定"。该软件生成每个模型的拟合结果。

结果

本研究显示，RG的精密度、稳定性、重复性和样品回收率均在中国药典（2020年第4卷）¹²规定的方法学范围内，表明该方法是可行的。经过反复调试，确定本研究中使用的洗脱梯度对RG中的三种指标组分具有良好的分辨率（图1）。RG中的3种指标组分在特定浓度范围内具有良好的线性关系（表2）。精密度测试结果（表3）显示，红景天?...

讨论

溶出度试验是模拟固体口服制剂在胃肠道¹⁵中崩解和溶出的理想体外方法。是评价和控制固体口服制剂质量的重要指标。因此，溶出度试验在固体药物口服制剂的开发中起着至关重要的作用¹⁶。特别是随着中药（TCM）质量控制技术的发展，溶出度测定已逐步应用于中药和民族药复方制剂的筛选研究^17，18。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chromatographic column	ZORBAX Eclipse	XDB-C18	4.6 mm x 250 mm, 5 µm
Drug dissolution tester	Shanghai Huanghai Pharmaceutical Inspection Instrument Co., Ltd.	RCZ-6B3
Electronic analytical balance	Shanghai Liangping Instruments Co., Ltd.	FA1004
Ethyl gallate (HPLC, ≥98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DSTDM006301
Function drawing software	OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA	2022
Gallic acid (HPLC, ≥98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DSTDM000802
High performance liquid chromatography	Agilent Technologies Singapore (International) Pte. Ltd.	Agilent 1260 Infinity
HPLC grade methanol	Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.	216565
Injector	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instrument Co., Ltd.	0.7 (22 G)
Millipore filter	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd	φ13 0.22 Nylon66
Rhodiola granules	Tibet Nodikang Pharmaceutical Co., Ltd.	210501
Salidroside (HPLC, ≥98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DST200425-037
Ultra pure water systemic	Merck Millipore Ltd.	Milli-Q
Ultrasonic cleansing machine	Ningbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., Ltd	SB-8200 DTS