使用液相色谱-串联质谱分析原发性痛经大鼠的原始和加工的Cyperi Rhizoma样品

摘要

在这里，使用超高效液相色谱-高分辨率串联质谱（UPLC-MS/MS）对原发性痛经大鼠的原始和加工的Cyperi rhizoma（CR）样品进行了比较分析。检查CR处理的大鼠和醋处理的CR（CRV）大鼠之间代谢物和样品成分的血液水平变化。

摘要

根瘤（CR）广泛用于妇科，是我国治疗妇女疾病的全科药物。由于用醋加工后CR的镇痛作用增强，因此临床上一般采用醋处理的CR（CRV）。然而，醋加工增强镇痛作用的机制尚不清楚。本研究采用超高压液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）技术检测CR处理和CRV处理痛经大鼠外源成分和代谢物血液水平的变化。结果显示，这些大鼠血液中的15种成分和两种代谢物含量不同。其中，CRV组的（-）-肉豆蔻醇和[（1R，2S，3R，4R）-3-羟基-1，4，7，7-四甲基双环[2.2.1]庚-2-基]乙酸水平明显高于CR组。CRV降低具有促炎、血小板聚集和血管收缩活性的2系列前列腺素和4系列白三烯的水平，并通过调节花生四烯酸和亚油酸代谢以及不饱和脂肪酸的生物合成提供镇痛作用。本研究表明，醋加工增强了CR的镇痛作用，有助于我们了解CRV的作用机制。

引言

原发性痛经（PD）是临床妇科中最普遍的疾病。它的特征是月经前或月经期间背痛、肿胀、腹痛或不适，生殖系统中没有盆腔病变¹.一份关于其患病率的报告显示，85.7%的学生患有PD²。低剂量口服避孕药是标准疗法，但其不良副作用，如深静脉血栓形成，引起了^{越来越多的关注3}。口服避孕药使用者深静脉血栓形成的患病率为每 1，000 名妇女 >1 例，在最初 6-12 个月和 40 岁以上的使用者中风险最高⁴。

长期用于传统中药（TCM），Cyperi rhizoma（CR）来源于Cyperaceae家族Cyperus rotundus L.的干燥根茎。CR调节月经紊乱，缓解抑郁和疼痛⁵.CR广泛用于妇科，被认为是治疗女性疾病的普通药物⁶。用醋（CRV）加工的CR通常用于临床。与CR相比，CRV显示出对月经和疼痛缓解的增强调节。现代研究表明，CR抑制环氧合酶-2（COX-2）和随后前列腺素（PGs）的合成，从而达到抗炎作用。同时，CR表现出无副作用的镇痛作用⁷，使CR成为痛经患者的不错选择。然而，CRV调节月经和缓解疼痛的机制尚不清楚。CR研究主要集中在其活性化学成分和药理活性的变化，如其抗炎，抗抑郁和镇痛作用⁸，^9，10，^11，12。

虽然中医的成分很复杂，但它们被吸收到血液中，必须达到特定的血液浓度才能有效¹³。通过利用血液中成分测定的策略，可以缩小中药活性成分的筛选范围。在体外研究化学成分时可以避免盲目，在研究单个成分时可以避免片面性¹⁴。通过比较血液中CR和CRV的组成，可以有效，快速地检测处理后的CR活性成分的变化。药物功效是药物影响身体的过程。由于身体的代谢反应引起的药物成分的变化，可能与药物的作用机制有关，可以用代谢组学来确定。代谢组学旨在测量整体和动态代谢反应，这与确定中药的整体疗效一致¹⁵。此外，代谢物是基因表达的最终产物，与表型¹⁶最密切相关。因此，代谢组学可能适用于探索CR和CRV在PD治疗中的代谢途径的差异。 基于液相色谱-高分辨率串联质谱（LC-MS/MS）的非靶向代谢组学具有高通量、高灵敏度和高分辨率的特点，可用于测量许多不同的小分子成分^17，18.该方法可以同时测定吸收到血液中的内源性代谢物和外源性成分。代谢组学已广泛应用于中医¹⁹、药物毒理^学20、健康管理21、运动²²、食品²³等领域。

本研究采用基于LC-MS/MS的非靶向代谢组学，测定CR处理和CRV治疗痛经模型大鼠血液中吸收的外源成分和内源性代谢物的差异，揭示CRV镇痛作用的机制。

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研究方案

所有与动物有关的实验均经重庆中医药研究院实验伦理委员会批准进行。本实验使用了24只8-10周龄，体重200克±20克的雌性Sprague Dawley大鼠（SD）。

1. 提取的准备

1. 计算
   1. 计划将CR或CRV提取物施用于六只Sprague-Dawley大鼠（10g / [kg∙day]）的治疗组3天。使用浓度为 1 g/mL 的 CR 或 CRV 提取物（1 mL 提取物来自 1 g 草药）。
      注意:CR的剂量为6-10克。在这项研究中，使用最大剂量10g作为剂量。由于成年人的平均体重为60公斤，成人剂量为0.1667克/公斤。根据重量转换算法²⁴，由于人与大鼠之间的剂量转换系数为6.3，因此大鼠的剂量为1.05 g/kg。大鼠用药剂量增加10倍至10.5g/kg。为方便计算和实际实验，剂量设定为10 g/kg。例如，通过计算，如果总共需要36克CR或CRV，则应至少制备两次中草药。因此，需要200 g CR - 使用100 g CR作为CR，并将100 g CR加工成CRV。
   2. 使用公式（1）计算每只大鼠要施加的CR或CRV的体积:
      V = 10 克/（公斤∙天） × 200 克/（1 克/毫升） = 2 毫升 （1）
2. CRV 的处理
   1. 彻底混合100gCR和20g醋（>5.5g乙酸/ 100mL）并孵育12小时。
      注意:为确保CR的内部在12小时后被醋润湿，将CR和醋混合，充分搅拌，然后再次搅拌直至内部湿润。
   2. 将混合物在110-120°C的铁锅中翻炒10分钟。 然后，取出混合物，让它在室温下冷却。
      注意:为防止CR烧焦，必须在加热时不断搅拌。如果处理后的CRV太湿，可以在60°C下干燥。 当CR表面为棕褐色时，可以停止炒菜。
3. 萃取
   1. CR提取物
      1. 向CR中加入10倍（CR量）纯水，浸泡2h。浸泡时确保药材低于液位。
         注意:CR只需要在提取前切成两半。浸泡的目的是更有效地提取活性成分。浸泡过程是必不可少的。
      2. 将水和药物的混合物用大火煮沸，并在小火下煮沸20分钟。用滤布（100目）过滤，并收集滤液。
         注意:煎煮时，煮沸前使用高温，并使用低火保持沸腾。
      3. 重复步骤1.3.1.2一次，并合并滤液。
      4. 用旋转蒸发器将提取物浓缩至1 g / mL（基于原始药物，浓缩温度必须低于60°C）。
         注意:CR中的活性成分是挥发性的，因此浓度温度不应高于60°C。
   2. CRV 提取物
      1. 执行与 CR 提取方法相同的步骤 （1.3.1.1-1.3.1.3）。
   3. 用于测试的 CR 提取物
      1. 将 500 μL CR 提取物和 500 μL 甲醇移液到 1.5 mL 微量离心管中，涡旋 30 秒混合。
         注意:甲醇和水的混合物可以更好地提取活性成分。不应直接过滤数据提取进行测试。
      2. 将每个样品在4°C下以1，6502 ×g 离心15分钟。 过滤上清液，然后将其转移到样品瓶中进行测试。
         注意:甲醇和提取物混合物高速离心后，上清液可直接转移到样品瓶中进行测定，无需过滤。由于离心过程产生的热量，最好使用低温离心机。
   4. 用于测试的 CRV 提取物
      1. 执行步骤 1.3.3.1-1.3.3.2 以准备用于测试的 CRV 数据提取。

2. 动物

1. 计算
   1. 取50毫克苯甲酸雌二醇，加入50毫升橄榄油中，制备1毫克/毫升溶液。取50mg催产素，加入50mL生理盐水中，制备1mg/mL溶液。
      注意:腹腔注射苯甲酸雌二醇和催产素的剂量为10mg /（kg∙天）。苯甲酸雌二醇溶于橄榄油，催产素溶于生理盐水。苯甲酸雌二醇不易溶于橄榄油，可以用超声波处理以加速溶解。苯甲酸雌二醇和催产素溶液必须每天制备。
   2. 计算每只大鼠施用的苯甲酸雌二醇溶液的体积（即V = 10mg / [kg∙day]×200g / [1g / mL] = 2mL）。计算每只大鼠要施用的催产素溶液的体积（即V = 10mg / [kg∙day] × 200g / [1g / mL] = 2mL）。
2. 动物分组和管理
   注:为管理分配了十天^25，26。在治疗期间，大鼠可以不受限制地获得标准食物和水。在催产素给药后30分钟内，跟踪每只大鼠的扭动活动。PD大鼠模型开发成功，模型大鼠的扭转反应包括子宫收缩、单肢旋转、后肢伸展、空心躯干和腹部收缩²⁶。
   1. 将24只雌性Sprague-Dawley大鼠（SD大鼠，8-10周龄，体重200g±20g）随机对照，模型，CR和CRV分为四组，并喂养它们7天。
   2. 动物管理
      1. 每天腹膜内注射模型，CR和CRV组中的大鼠2mL苯甲酸雌二醇溶液。腹膜内向对照组的大鼠注射2mL生理盐水。
      2. 从第 8 天开始，完成步骤 2.2.2.1。然后，向CRV组的大鼠胃内施用2mL CRV提取物，向CR组大鼠施用2mL CR提取物，向对照组和模型组的大鼠施用2mL生理盐水。
      3. 在第 10 天，完成步骤 2.2.2.2。然后，腹膜内向模型，CR和CRV组中的大鼠注射2mL催产素溶液，对照组中的大鼠注射2mL生理盐水。
   3. 记录催产素注射后30分钟内大鼠的扭动时间。
3. 样品采集
   1. 收集腹主动脉血样，快速彻底切除子宫，并小心分离粘附在子宫壁上的结缔组织和脂肪。
      注意:在最终剂量后1小时内收集血液。
   2. 使用微量离心管保存子宫组织并将其转移到液氮中。将组织样品储存在-80°C。
   3. 将血液样品以4，125× g离心10分钟。除去含血清的上清液，并在4°C下以16，502× g 离心10分钟。 离心血清，然后将其保存在-80°C的管中储存。
      注意:血液样本必须在室温下放置1小时以进行再处理。
4. 来样加工
   1. 血清样本
      1. 将 400 μL 甲醇和 200 μL 血清放入微量离心管中，涡旋 30 秒混合。将每个样品在4°C下以16，502× g 离心15分钟。 收集并过滤后，用上清液填充样品瓶。将每个样品中的所有上清液与相同体积混合，以制备用于测试的质量控制样品。
   2. 子宫组织样本
      1. 从同侧段取100毫克子宫组织，并用9倍体积的生理盐水研磨。将匀浆以4，125× g离心10分钟，并收集上清液。将上清液置于4°C的冰箱中进行测试，如果不在同一天测试，则置于-80°C的冰箱中。
      2. 将生理盐水，纸巾和钢球放入2mL微量离心管中，将微量离心管放入液氮中3-5秒，然后将组织放入组织粉碎机中进行研磨。
5. 样品测试
   1. 使用酶联免疫吸附测定（ELISA）测量大鼠样品子宫组织中的PGF_2α 和PGE₂ 含量。
      注意:大鼠PGE 2 ELISA试剂盒用于测量PGE₂含量，大鼠PGF 2α ELISA试剂盒用于测量PGF_2α水平。详细步骤可以在制造商的说明中找到。材料表中给出了套件的详细信息。
   2. 使用UPLC-MS/MS评估血清样本、CR提取物和CRV提取物。
      1. 对于UPLC，使用C18色谱柱（2.6 μm，2.1 mm x 100 mm）和二元梯度法，流动相A含有0.1%甲酸，流动相B含有乙腈。洗脱梯度设置如下:从0分钟到1分钟，15%B;从1分钟到8.5分钟，15%到85%B;从8.5分钟到11.5分钟，85%B;从11.5分钟到11.6分钟，99%到1%B;从11.6分钟到15分钟，15%B.将流速设置为0.35mL / min，进样体积设置为2μL。
      2. 对于MS，将温度设置为600°C，帘式气体（CUR）流量设置为0.17MPa，护套和辅助气体流量设置为0.38MPa。将正离子模式和负离子模式的离子喷雾电压分别设置为5.5 kV和-4.5 kV，将去簇电位（DP）电压设置为80 V或-80 V，将碰撞能量（CE）设置为40 eV或-25 eV，将碰撞能量叠加（CES）设置为35 eV±15 eV。
      3. 使用UPLC-MS/MS按照制造商的方案进行测试，对50-1，000 m/z的质量范围进行MS。
      4. 使用匹配工作站程序结合检测模式的信息相关采集、多质量数缺陷过滤器和动态背景推断，获取UPLC-MS/MS结果。使用混合血清的质控样品测试UPLC-MS/MS设备的重复性和稳定性，以验证常规方法。在研究样品之前，连续四次注射质控样品，然后在每五个血清样品后注射。

3. 数据处理

1. 数据准备
   1. 使用转换软件将原始数据转换为 mzXML 格式。归一化每个样品的总离子电流 （TIC） 数据。
      注意:基于XCMS构建的基于R的内部应用程序（www.lims2.com）用于分析积分，对齐，提取和峰检测的信息²⁷。
   2. 使用专有的 MS² 数据库 （www.lims2.com） 进行代谢物注释。将注释阈值设置为 0.3²⁸。
      注意:在每组中鉴定内源性代谢物。
2. 主成分分析和正交偏最小二乘判别分析
   1. 使用分析软件执行主成分分析 （PCA） 和建模。将代谢物的标准化数据导入分析软件。然后，使用 自动调整 来构建分析模型。最后，使用分数得到PCA的 分数 散点图。
      注意:每个组的聚类是用 PCA 的分数散点图获得的。PCA是一种无监督分析模式，主要通过降维对样品进行分组，无需干预。
   2. 使用分析软件执行正交偏最小二乘判别分析 （OPLS-DA）。
      1. 将CR和CRV组中代谢物的标准化数据导入分析软件。
      2. 将CR组的数据导入到创建的CR组中，并将CRV组的数据导入到创建的CRV组中。
         注意:OPLS-DA是一种监督分析模式，需要对样品进行分组。
      3. 然后，使用 自动拟合 构建分析模型，并使用分数获得OPLS-DA的 分数 散点图。最后，使用VIP获取OPLS-DA中投影（ VIP ）值中的可变显著性。
         注意:CR和CRV组中代谢物的投影（VIP）值的可变意义是通过OPLS-DA获得的。
3. 鉴定潜在的差异代谢物
   1. 筛选出步骤3.2.2.3中VIP值大于1的代谢物。
   2. 使用统计软件计算在步骤3.3.1中通过学生t检验筛选出的代谢物的P值。
      注意:CR组和CRV组中潜在差异代谢物的显着差异由学生t检验确定。潜在的差异代谢物是学生的t检验p值<0.05且投影（VIP）中的可变显著性大于1的代谢物。该表示是使用火山图完成的。
4. 鉴别鉴别代谢物
   1. 筛选出步骤3.3中潜在的差异代谢物。使用步骤3.1.2的结果来鉴定这些差异代谢物。
      注意:鉴定了少量潜在的差异代谢物，它们成为候选的差异代谢物。
   2. 筛选出要在KEGG数据库中匹配的差异代谢物。通过绘制热图显示CR和CRV组中差异代谢物的变化。
      注意:少数候选差异代谢物被匹配，它们成为差异代谢物。
5. 检查潜在的代谢途径
   1. 将不同的代谢物上传到代谢分析师（www.metaboanalyst.ca）数据库。
   2. 使用通路分析获得潜在的代谢 通路 。
      注意:在CR和CRV组中获得了潜在的代谢途径。 P 值和影响值是关键路径选择的两个非常重要的指标。 P 值比影响值更重要。显著性由 P 值定义 < 0.05;更大的影响值与更好的相关性相关。
   3. 通过将不同的代谢物上传到KEGG（http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html）数据库来分析潜在的代谢途径。
      注意:还应考虑代谢途径的功能与PD之间的关系。获得关键的代谢途径。
6. 识别吸收到血液中的成分
   1. 使用内部 MS² 数据库 （www.lims2.com）、人类代谢组数据库 （HMDB） 以及 Massbank 和 Chemspider 数据库鉴定 CR 和 CRV 提取物中的化学成分。
   2. 确定CR和CRV组中吸收到血液中的成分，并比较CR和CRV组之间的成分。
      注意:吸收到血液中的成分必须在CR或CRV组中检测到，但在对照组中无法检测到。
7. 统计分析
   1. 使用单变量分析 （UVA） 和多变量统计方法分析数据，包括方差分析 （ANOVA） 和学生 t 检验。
      注意:实验信息使用统计软件作为平均±标准差（±SD）表示。 P < 0.01 被认为是非常显著的差异， P < 0.05 代表显著差异²⁸。

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结果

痛经模型实验分析
对照组30分钟内无扭动反应，因为这些大鼠未腹腔注射催产素和苯甲酸雌二醇引起疼痛。模型组、CR组和CRV组的大鼠在注射催产素后表现出大量的扭动反应。这些结果证明了苯甲酸雌二醇和催产素联合用药诱导痛经的疗效。模型组和对照组之间PGF 2α、PGE 2和PGF_2α/PGE₂水平的差异显著（P < 0.001，P < 0.05），证明了 模型的有效性（...

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讨论

由于中药种类繁多，性质各异，这些中药材有时在临床上不起作用，这可能是由于中药加工和煎煮不当造成的。随着当代科学技术的使用，中医的机制变得越来越明显^29，30.本研究表明，CR和CRV均对PD模型大鼠具有治疗效果，且CRV的治疗效果更为显著。CRV的作用机制可能与醋加工可能影响被吸收到血液中的CR成分有关，并且可能与亚油酸代谢和不饱和脂肪...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA	197164
BECKMAN COULTER Microfuge 20	Beckman Coulter, Inc.	MRZ15K047
Estradiol benzoate	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd	C10042616
formic acid	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA	177799
LC 30A system	Shimadzu, Kyoto, Japan	228-45162-46
Olive oil	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd	H25A11P111909
Oxytocin synthetic	Zhejiang peptide biology Co., Ltd	2019092001
Rat PGF2α ELISA kit	Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd	202101
Rat PGFE2 ELISA kit	Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd	EDL202006217
SPF Sprague-Dawley rats	Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd	Certificate number SCXK (Hunan) 2019-0004
Tecan Infinite 200 PRO	Tecan Austria GmbH, Austria	1510002987
Triple TOF 4600 system	SCIEX, Framingham, MA, USA	BK20641402
water	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA	152720