骨细胞的分析和成像

摘要

本研究概述了在腔隙-小管网络 （LCN） 内可视化和开发骨细胞三维 （3D） 模型以进行计算流体动力学 （CFD） 分析的方法。使用这种方法生成的模型有助于了解健康或患病骨骼中的骨细胞机械感觉。

摘要

骨细胞是被认为通过在称为机械转导的过程中激活各种生物途径来响应机械应变和流体流动剪切应力 （FFSS） 的骨细胞。骨细胞网络的共聚焦图像衍生模型是进行计算流体动力学 （CFD） 分析以评估骨细胞膜上的剪切应力的宝贵工具，而骨细胞膜上的剪切应力无法通过直接测量来确定。使用这些骨骼微观结构的高分辨率图像进行计算建模，以数值模拟施加在骨骼上的机械负荷，并了解负荷诱导的骨细胞刺激。

本研究详细阐述了使用套管网络 （LCN） 的共聚焦显微镜图像开发 3D 单骨细胞模型的方法，以利用各种计算建模软件进行 CFD 分析。在共聚焦显微镜检查之前，将小鼠骨骼切片并用异硫氰酸荧光素 （FITC） 染料染色以标记 LCN。在 100 倍分辨率下，使用共聚焦显微镜收集 Z 堆栈图像并导入 MIMICS 软件（基于 3D 图像的处理软件），以构建 LCN 和骨细胞树突状过程的表面模型。

然后使用 3-Matic 软件（3D 数据优化软件）中的布尔运算减去这些表面，以模拟骨细胞细胞体周围的腔隙流体空间和含有腔隙小管液的树突周围的小管空间。将 3D 体积流体几何结构导入 ANSYS 软件（仿真软件）进行 CFD 分析。ANSYS CFX（CFD 软件）用于在骨骼上施加流体压力的生理载荷，并确定骨细胞和树突突上的壁剪切应力。LCN 的形态会影响骨细胞细胞膜和细胞过程感应到的剪切应力值。因此，如何开发基于图像的共聚焦模型的细节对于理解骨细胞机械感觉很有价值，并且可以为该领域的未来研究奠定基础。

引言

骨细胞被假定为响应体育锻炼而调节骨量¹。由于机械负载，骨细胞的膜变形及其树突状过程使它们受到 FFSS，FFSS 被骨细胞检测到并触发细胞内信号转导 ^2,3,4。由于衰老或骨病（如骨质疏松症和糖尿病）以及 perlecan 缺乏症等导致骨细胞机械反应受损的情况，骨微结构会经历其腔隙-小管形态的恶化或改变 ^5,6。骨结构的这些变化导致骨细胞经历不同程度的 FFSS 和应变 ^7,8。重要的是，骨细胞响应机械负荷而经历的 FFSS 在体内很难量化，因为它们嵌入钙化的骨基质中。

基于图像的共聚焦建模是一种强大的技术，通过复制 LCN 的计算机模型来克服在自然环境中研究难以接近的骨细胞的局限性 ^9,10。在 3D 中处理和建模 LCN 的互连网络一直具有挑战性。有几种成像技术，例如透射电子显微镜 （TEM）、扫描电子显微镜 （SEM）、连续块面切片和连续聚焦离子束扫描电子显微镜 （FIB/SEM）^2,11,12。开发了一种有价值的技术，可以通过共聚焦激光扫描显微镜 （CLSM） 可视化骨骼^13、14、15 并生成 3D 骨细胞模型。这里选择 CLSM 进行计算建模而不是其他成像技术，因为它能够在 3D 中对所有腔隙体积和大部分小管进行成像^16,17。可以使用 CLSM 生成 LCN 几何结构，以进行骨细胞有限元分析 （FEA） 以预测骨骼应变。然而，预测骨细胞经历的 FFSS 的流体分析更为复杂，因为它需要对 LCN 内骨细胞的细胞膜及其树突进行建模，以便能够对狭窄的腔隙-小管空间进行建模，其中间质液在¹⁸ 附近移动。

在该方案中，在共聚焦显微镜检查之前，将异硫氰酸荧光素 （FITC） 染料应用于未脱钙的厚骨切片上，以标记骨内的 LCN，并根据来自 LCN 的成像数据对骨细胞 - 树突状膜进行建模。使用计算建模模拟腔隙-小管空间，并使用 CFD 方法对体力活动引起的生理负荷进行建模。在 CFD 软件中对骨细胞进行流体压力梯度，以分析 LCN 内的液体概况并测量骨细胞和树突状膜上的 FFSS。此外，FEA 方法可以通过施加压缩机械载荷来测量骨细胞应变或应力。

还开发了一种几何修改技术来修改从年轻、健康骨骼图像中获得的微观结构，以模拟老年动物或患有骨病的动物改变的腔隙-小管形态。骨微观结构的改变包括随着年龄的增长减少小管的数量，减少腔隙-小管间隙面积以模拟 Perlecan 缺乏症发生的情况，并增加腔隙-小管间隙面积以模拟衰老效应，以及减少小管和树突壁面积以模拟糖尿病骨 ^5,6。几何修改技术使我们能够比较具有不同微观结构的骨骼中骨细胞所经历的 FFSS，例如年轻与衰老或健康动物与患病动物的骨骼。

总体而言，基于图像的共聚焦建模是模拟健康骨骼中骨细胞形态以及骨细胞形态中衰老/疾病相关变化的宝贵工具。此外，可以在各种骨骼中测量和比较骨细胞形态参数，例如腔隙-小管间隙的表面积和体积，以预测细胞对机械应变的反应。

研究方案

动物实验是在密苏里大学堪萨斯城分校 （UMKC） 机构动物护理和使用委员会的批准下进行的，并符合相关的联邦指导方针。

1. 骨骼准备过程

1. 收集 4 个月大和 22 个月大的雌性 C57BL6 小鼠的股骨，并在 4 °C 下在 PBS 中的冷 4% 多聚甲醛中轻轻摇动固定 24 小时，然后在 PBS 中冲洗并储存在 70% 乙醇中，然后嵌入。
   注意:固定剂体积应约为组织体积的 20 倍
2. 按照制造商的说明将骨骼快速嵌入快速聚合的丙烯酸树脂（材料表）中。
   注:对于此步骤（~10 分钟），使用快速聚合树脂很重要。目的是在使用金刚石锯进行切片时支撑骨组织，但树脂不会渗透到 LCN 中，这会阻止 FITC 染色渗透。
3. 使用金刚石锯从第三转子上方的标准化部位切下 300 μm 厚的横向切片，并在 FITC 染色前将它们储存在 4 °C 的 70% 乙醇中。
4. 使用 600、800 和 1200 粒度的砂纸抛光切片，最终厚度为 ~90-100 μm。
   注意:使用数字卡尺可确保获得适当的厚度。
5. 用 70%、95% 和 100% 乙醇冲洗切片，各 5 分钟。
6. 在室温 （RT） 下在室温 （RT） 下在 100% 乙醇中染色 4 小时，并适度摇晃。
7. 在 100% 乙醇中洗涤切片 30 分钟，并在黑暗中轻轻摇晃。然后，在黑暗中风干一夜。
8. 安装时，将切片放入玻璃显微镜载玻片上的一滴安装介质中。使用镊子将切片尽可能平放在载玻片上，避免产生气泡并使用周围的树脂作样品。在标本上安装盖玻片。

2. 共聚焦显微镜

1. 使用共聚焦显微镜对 FITC 染色的骨切片进行成像。
2. 使用数码变焦为 1.7 且步长为 0.126 μm 的 100x 1.44NA 油物镜以 1024 x 1024 像素、0.089 μm 像素分辨率收集 400 个 Z 平面的详细 Z 堆栈。
3. 使用 488 nm 激光器进行激发，发射收集窗口为 496-596 nm。使用补偿设置收集图像堆栈，以校正随着成像深度增加的信号损失。
4. 通过使用图像收集技术（如过度采样和增加线平均化）来提高图像的准确性和分辨率。此外，以 5 倍、20 倍和 100 倍分辨率的放大倍率收集股骨切片的图像，如图 1 所示。
   注意: 图 1 中的低分辨率 （5x） 图像显示了股骨的完整横截面积，其中选择了三个区域进行 100x 成像视野。
5. 使用 100x Z 堆栈进行骨细胞的计算机建模。

3. 计算机建模

1. 将收集的 100x 图像以 TIFF 格式导入 ImageJ 软件，以在 Z 方向构建 LCN 的图像序列。
2. 将 Z 堆栈导入基于 3D 图像的处理软件中，以在定义图像方向后构建 LCN 的掩码。
3. 将年轻和老年小鼠的原始图像分别在 30,012-45,677 个 Hounsfield 单位和 15,000-46,701 个 Hounsfield 单位之间，使其与 LCN 非常相似。调整部分菜单中的 Threshold 以更改包含在蒙版中的像素强度限制。
4. 使用 Crop Mask 作从堆栈中裁剪一个腔隙，并将其小管作为感兴趣区域 （ROI）。定义 ROI，使其环绕立方体中心的空隙，并且其所有连接的小管都延伸到立方体的侧面。将空隙包裹在边长为 21 μm、14 μm 和 19 μm 的假想的更大立方体中。
5. 由于模型是由多个部分创建的，因此请执行区域增长作以选择连接的像素区域，去除噪声和去斑以生成均匀的 LCN。
6. 使用基于 3D 图像的处理软件中的 计算部分 作将腔隙小管蒙版转换为对象。
7. 通过使用 Smoothing 作减少 LCN 体积来构建骨细胞和树突状膜。多次执行此作，以分别获得 0.75 μm 和 0.08 μm 的腔隙和小管间隙厚度 ^9,18。
8. 导出对象（STL 格式）作为基于 3D 图像的处理软件的最后一步。
9. 将两层 LCN 和骨细胞树突状膜导入 3D 数据优化软件中，以生成体积网格。
10. 利用软件中的 修复向导 工具来识别每个零件中的网格问题。每次作后，在 Fix Wizard 的诊断部分中检查网格质量。
11. 使用 Fix Wizard 中的 Auto-Fix作删除倒置的法线部分、相交三角形和不良轮廓。
12. 通过定义新三角形来手动替换重叠三角形，或通过 Fill Hole Normal 作自动替换重叠三角形。
13. 使用包括过滤锐三角形、小边和小壳在内的作提高网格质量。
14. 提高网格质量后，使用非歧管组件将 LCN 和骨细胞树突状膜的两个表面组合成一个表面（腔隙 - 小管流体空间），该表面属于两个部分。
15. 使用 Remesh 作创建腔隙-小管空间的体积模型，然后将其导出为 STL 文件。在导出部分中将对象比例调整为以微米为单位。

4. 基于 3D 图像的处理软件和 3D 数据优化软件中的几何修改技术

注意:几何修改技术用于模拟骨细胞形态的变化，例如由于衰老或骨骼疾病引起的小管密度和直径以及腔隙-小管厚度。

1. 选择年轻的骨细胞作为基本模型，并通过应用形态改变对其进行修改以构建其他不同的骨细胞模型。
2. 通过在基于 3D 图像的处理软件中更改图像阈值，从基础模型生成具有不同小管密度的骨细胞模型。
   1. 选择较低的阈值可降低图像的光强度并获得具有较少小管的空白。阈值技术的优点是腔隙形状和大小保持不变，并且仅研究小管密度的影响。 图 2 显示了使用几何修改技术从年轻骨细胞生成的模拟衰老模型。
3. 在基于 3D 图像的处理软件和 3D 数据优化软件中开发具有不同腔隙-小管间隙厚度或树突/小管直径的骨细胞模型。分别通过 Wrapping 或 Smoothing 作构建更大或更小的骨细胞模型。 图 3 显示了从年轻骨细胞发育而来的六种几何形状改变的骨细胞模型。

5. CFD 分析

注意:生成体积骨细胞模型后，在模拟软件的 CFX 模块中执行几个步骤，包括几何、网格和设置。

1. 在仿真软件中创建流体流动，以准备用于 CFD 分析的模型。
2. 将开发的基于图像的共聚焦几何图形导入 CFX 的几何部分，称为 ANSYS SpaceClaim（3D 建模工具）。在设置中将 unit dimensions 设置为 nanometers。
3. 几何形状表现为 LCN 和骨细胞树突突的两个方面。单击顶部菜单上的" 小平面 "，并删除几何错误，例如每个小平面的交叉点、尖锐或过度连接的边缘以及顶点、开口或孔。
4. 单击 Facet 菜单上的 Subtract 以减少较大小面 （LCN） 的较小小面和骨细胞树突，以实现腔隙-小管间隙的单个体。然后，右键单击生成的 facet 并将其从 facet 转换为实体域，而不合并面。图 4 描述了年轻骨细胞模型的横截面积，它代表腔隙-小管间隙。
5. 单击网格并选择使用 0.06 μm 单元大小的线性四面体单元。使用网格收敛算例优化网格，以在微小的树枝状系统中具有足够的单元，以确保结果与网格大小无关。
6. 选择表面，然后选择假想立方体顶部的小管作为流体入口。使用 框 选选择其他五个面上的小管作为流体出口。
7. 导出网格 （Fluent 文件格式），因为它在下一步的设置中加载速度更快。
8. 在仿真软件中创建另一个 Fluid Flow，并将 Fluent 网格导入到 CFX 的设置部分。使用 Insert Boundary 选项为预先选择为入口/出口的面定义入口和出口的两个边界条件。
9. 为了模拟生理条件，对入口和出口施加 300 Pa 和 0 Pa 的流体入口压力，分别为^19,20。将其余表面视为该流体中具有无滑移条件的壁，该流体在壁界面处的速度为零。液体从树突和骨细胞体周围的入口流出，并从指定为出口的其他小管流出。
10. 将间质层流视为水⁹，从材料库中选择。将 Heat Transfer、Combustion 和 Thermal Radiation 部分设置为 None，因为问题中未定义传热。选择 湍流 模式作为 LCN 中的流体特性，LCN 是层流⁹。
11. 使用 Double Precision 和 Direct Start 作为提交类型运行软件。监测质量和动量，直到残差下降并变得恒定。解收敛后，使用 CFD 软件的 CFD-post 部分测量 FFSS 数据。

6. CFD 后处理

1. 要描述骨细胞及其树突所经历的 FFSS，请在 CFD 软件的结果部分插入新的轮廓。通过选择骨细胞树突状膜上的壁剪切作为结构域的变量来创建 FFSS 轮廓。
   注:为了更好地显示树突状膜上的高 FFSS，将 FFSS 的范围设置为 用户指定 以修改 FFSS 的最小/最大值。
2. 从入口开始，在腔隙-小管域内插入速度流线等值线。将采样设置为等距，并选择点数作为 2500。CFD 软件中的动画部分使用速度流线图以 3D 形式准确显示流体粒子如何在空隙-小管空间内流动。
3. 使用 CFD 软件中的 函数计算器 工具根据几何参数分析 FFSS 或速度的大小，尤其是在存在各种骨细胞模型（即年轻与老年）的情况下。将腔隙-小管空间的体积和表面积作为几何参数以及最大、最小或平均 FFSS 值进行测量。

结果

该协议描述了如何开发共聚焦衍生的骨细胞模型，以研究骨细胞及其树突由于机械载荷而承受的流体流动剪切应力的大小。选择一只老年和一只年轻的 C57BL6 小鼠来构建基于年轻和老年共聚焦图像的骨细胞模型。使用几何修改技术从相同的年轻骨细胞模型生成其他六个模拟骨细胞模型，以研究由于衰老或骨骼疾病引起的 LCN 形态改变。几何修改后的参数包括腔隙-小管厚度?...

讨论

该协议概述了一种用于骨细胞可视化和计算建模的共聚焦成像技术。在共聚焦成像之前，进行骨样本切片和染色的骨制备过程。将 100 倍放大倍率的共聚焦图像导入各种软件中，以开发骨细胞和腔隙-小管间隙的计算机模型。最后对基于共聚焦图像的模型进行 CFD 分析，以模拟由于身体活动而导致的骨细胞和树突状膜周围的 FFSS，由于骨基质中骨细胞的不可接近，这在 体...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,200 Grit sandpaper	Buehler	30-5170-012-100
3-Matic software	Materialise	https://www.materialise.com/en/industrial/software/3-matic	3D data optimization software
600 grit sandpaper	Buehler	30-5118-600-100
800 Grit sandpaper	Buehler	30-5170-800-100
ANSYS software	ANSYS	https://www.ansys.com/	simulation software
Fluorescein Isothiocyanate (FITC)	Sigma-Aldrich	F7250
ImageJ software		https://imagej.net/ij/
Immersion Oil for Microscopes	Leica Microsystems	195371-10-9
Leica TCS Sp5 II confocal microscope	Leica Microsystems	TCS Sp5 II
Leitz 1600 inner hole diamond saw	Leica
MIMICS Innovation Suite software	Materialise	https://www.materialise.com/en/healthcare/mimics-innovation-suite	3D image-based processing software
Permount mount medium	Fisher scientific	SP15-500
Sampl-Kwick Fast Cure Acrylic Kit	Buehler	20-3560
Single Platform Laboratory Shaker	Reliable scientific INC	Model 55S