AlDeSense在基于醛脱氢酶1A1活性的卵巢癌细胞分层中的应用

摘要

测量活细胞中 ALDH1A1 活性的方法在癌症研究中至关重要，因为它是干性的生物标志物。在这项研究中，我们采用了亚型选择性荧光探针来确定一组五种卵巢癌细胞系中 ALDH1A1 活性的相对水平。

摘要

癌症治疗后的复发通常归因于称为癌症干细胞（CSC）的肿瘤细胞亚群的持续存在，其特征在于其显着的肿瘤起始和自我更新能力。根据肿瘤的起源（例如卵巢），CSC表面生物标志物谱可能会有很大差异，这使得通过免疫组织化学染色 鉴定 此类细胞是一项具有挑战性的工作。相反，醛脱氢酶 1A1 （ALDH1A1） 因其在几乎所有祖细胞（包括 CSC）中的保守表达谱而成为鉴定 CSC 的极好标志物。ALDH1A1 亚型属于 19 种酶的超家族，负责将各种内源性和异生素醛氧化成相应的羧酸产物。Chan等人最近开发了AlDeSense，这是一种用于检测ALDH1A1活性的亚型选择性“开启”探针，以及一种非反应性匹配对照试剂（Ctrl-AlDeSense），用于解决脱靶染色。这种亚型选择工具已被证明是一种多功能化学工具，可检测 K562 骨髓性白血病细胞、乳腺球和黑色素瘤衍生的 CSC 异种移植物中的 ALDH1A1 活性。在本文中，通过额外的荧光法、共聚焦显微镜和流式细胞术实验展示了探针的实用性，其中在一组五种卵巢癌细胞系中测定了相对 ALDH1A1 活性。

引言

癌症干细胞（CSC）是具有干细胞样特性的肿瘤细胞亚群¹。与非癌性对应物类似，CSC具有非凡的自我更新和增殖能力。与其他内置机制（例如ATP结合盒转运蛋白的上调）一起，CSC通常免于初始手术减瘤工作以及随后的辅助治疗²。由于CSCs在治疗耐药^性3，复发⁴和转移⁵中的关键作用，已成为癌症研究的优先事项。尽管有多种细胞表面抗原（例如CD133）可用于鉴定CSC⁶，但利用细胞质中发现的醛脱氢酶（ALDH）的酶活性已成为一种有吸引力的替代方法⁷。ALDHs 是 19 种酶的超家族，负责催化反应性内源性和异生素醛氧化为相应的羧酸产物⁸。

一般来说，醛解毒对于保护细胞免受可能损害干细胞完整性的不良交联事件和氧化应激至关重要⁹。此外，1A1亚型控制视黄酸代谢，而视黄酸代谢又通过视黄醛信号传导影响干性¹⁰。AlDeSense 11，¹² 是一种基于活性的小分....

研究方案

1. 通过荧光法 测量 卵巢癌细胞匀浆中的总 ALDH1A1 活性

1. 在 5 mL 以下细胞培养基中的 T25 细胞培养瓶中解冻 1 ×^{10 6} 个细胞：
   1. IGROV-1 和 PEO4：罗斯威尔公园纪念研究所 （RPMI） 1640 培养基，含 10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素/链霉素 （P/S）。
   2. BG-1和Caov-3：Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM），具有10%FBS和1%P / S。
   3. OVCAR-3：RPMI 1640，含 20% FBS、1% P/S 和 0.01 mg/mL 胰岛素。
2. 将细胞保持在37°C和5%CO₂ 的培养箱中两到三次传代。在传代前，确保细胞的汇合度不超过80%-90%。
3. 将细胞在0.25%胰蛋白酶中胰蛋白酶消化10分钟，使用自动细胞计数器计数，并通过在25°C下离心（180×g）沉淀1×10⁷个细胞5分钟。
4. 通过抽吸 小心 地除去上清液，通过将细胞重悬于1 mL 1x PBS中来洗涤沉淀，并在与步骤4相同的条件下通过离心 重新 沉淀细胞。
5. 将细胞重悬于1x PBS中的1x蛋白酶抑制剂溶液中。每 2.5 × 10⁶

结果

卵巢癌细胞匀浆的总 ALDH1A1 活性
从该测定中获得的每个细胞系的平均折叠开启为：BG-1（1.12±0.01）;IGROV-1（1.30 ± 0.03）;Caov-3（1.72 ± 0.06）;PEO4 （2.51 ± 0.29）;和OVCAR-3（10.25±1.46）（图2）。

图 2：通过荧光法测量的每?.......

讨论

泛选择性是许多 ALDH 探头的主要限制;然而，最近报道了几种亚型选择性实例32，³³，34，35，^36，37，³⁸，³⁹，^40，41。本研究中使用的亚型选择性?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate	Corning	25-050-CI
1x Phosphate Buffer Saline	Corning	21-040-CMX12
AccuSpin Micro 17R	Fisher Scientific	13-100-675
AlDeSense			Synthesized in-house
BG-1			A gift provided by the Prof. Paul Hergenrother Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
BioLite 25cm2 Flask	Thermo Fisher Scientific	130189
Biosafety Cabinet 1300 series A2	Thermo Fisher Scientific
Caov-3			A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
Cell homogenizer	Fisher Scientific
Centrifuge 5180R	Eppendorf	22627040
Contrl-AlDeSense			Synthesized in-house
DMEM, 10% FBS, 1% P/S			Prepared by UIUC cell media facility
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5mL	Corning	352003
FCS Express 6			Provided by UIUC CMtO
FL microscope	EVOS
Fluorometer	Photon Technology International
Forma Series II Water-Jacketed CO2 Incubator	Fisher Scientific	3110
IGROV-1			A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
ImageJ	NIH
Innova 42R Incubated Shaker
LSM 700	Zeiss
LSR II	BD
Nunc Lab-Tek Chambered #1.0 Borosicilate Coverglass System	Thermo Fisher Scientific	155383
OVCAR-3	ATCC	HTB-161
PEO4			A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
Pierce Protease Inhibitor Tablets	Thermo Scientific	A32963
Poly-L-Lysine	Cultrex	3438-100-01
Rocker	VWR
RPMI, 10% FBS, 1% P/S			Prepared by UIUC cell media facility
RPMI, 20% FBS, 1% P/S, 0.01 mg/mL Insulin			Prepared by UIUC cell media facility