探索两种草药组合策略治疗受损PC12细胞

摘要

该协议提供了两种草药的组合策略来治疗受伤的PC12细胞。该方案为优化中药最佳应用模式提供了参考。

摘要

针对中药联合治疗脑缺血的优势，我们研究了制剂组合和成分组合在疗效和机制上的差异，以探讨两种中药联合治疗损伤PC12细胞的策略。氯化钴（CoCl₂）与无葡萄糖培养基结合诱导PC12细胞的氧化损伤。然后，选择 蒙古黄 芪（Ast）和 短黄芪 （Eri）注射液的最佳组合，在筛选其在PC12细胞上安全有效浓度后，按照统一的设计方法进行组合。此外，筛选的组分组合包括两种草药中的10μM黄芪甲苷A、40μM黄芩苷和75μM绿原酸。然后，采用MTT、膜联蛋白V-FITC/PI、免疫荧光和蛋白质印迹分析，评价制剂组合和组分组合对损伤PC12细胞的疗效和机制。结果表明，细胞促存活的最佳制备组合是Ast注射液和Eri胶囊，浓度为6:1.8（μM）。组分组合（10 μM黄芪甲苷A、40 μM黄芩苷和75 μM绿原酸）比制剂组合更有效。两种组合均显著降低细胞凋亡速率、半胱天冬酶-3的荧光强度和细胞内活性氧（ROS）水平;同时，他们上调了p-Akt/Akt、Bcl-2/Bax和Nrf2的表达水平。这些影响在组件组合中更为明显。总之，两种组合都可以抑制CoCl₂ 与无糖培养基联合对PC12细胞诱导的损伤，从而促进细胞存活。然而，组分组合相对于制备组合的效率可能是由于其对与氧化应激和细胞凋亡相关的PI3K/Akt/Nrf2信号通路的更强调节。

引言

慢性脑缺血，由脑灌注不足引起，是中老年人常见病¹。作为一种长期隐匿性缺血性疾病，可导致进行性或持续性神经功能障碍。主要病理机制包括细胞凋亡和氧化损伤，导致进行性或持续性神经功能障碍;这是阿尔茨海默病、血管痴呆等疾病的病理基础，严重影响患者的生活质量。然而，现代医学中仍然缺乏治疗慢性脑缺血的理想药物^2。同时， 蒙古黄芪 （Ast）和 短黄芪 （Eri）的组合已广泛应用于中医（TCM^）的临床实践中4。联合策略在促进脑缺血后神经功能恢复方面有明显改善，优于单一药物;但是，^{两种药物组合}的剂量比例存在较大差异4。其有效成分和作用机制尚不明确，是制约其临床应用的关键问题。

已有研究证明了Ast注射液和Eri注射液制剂组合治疗大鼠脑缺血的协同作用。它可以上调p-Akt蛋白的表达，下调Bcl-2相关死亡启动子（BAD）蛋白⁵，⁶的表达，Bcl-2是B淋巴母细胞瘤2（Bcl-2）家族蛋白之一^，具有促进细胞凋亡的作用。但其协同效应的物质基础和机制尚不清楚。此外，利用CoCl₂组合无糖培养基建立了PC12细胞的损伤模型，筛选并定义了Ast和Eri的最佳成分组合⁷。

在这项研究中，通过使用受伤的PC12细胞模型筛选Ast和Eri的有效剂量。利用该模型结合均质设计方法筛选两种药物的最佳组合。细胞模型用于进一步评估制备组合和组分组合在受伤PC12细胞中的作用和机制的差异。该策略旨在通过PI3K/Akt/Nrf2信号通路探索两类组合对损伤PC12细胞的保护作用和调控机制，以确定最佳组合模式。本研究为优化中药最佳应用模式提供参考。

研究方案

1. 试剂的制备

1. 通过在 125 mL 无菌培养瓶中加入 90 mL DMEM 高糖培养基、10 mL 胎牛血清 （FBS） 和 1 mL 青霉素-链霉素溶液来制备完整培养基。混合完整的培养基，并在封闭条件下储存在4°C。
2. 通过在 10 mL DMEM 无糖培养基（完全溶解）中加入 0.02 g CoCl 2 粉末（准确称量）来制备 CoCl₂ 溶液，以获得 8.4 mM 储备溶液。用0.22μm细菌过滤器过滤溶液，密封，并将其储存在4°C避光。
   注意:CoCl₂ 不稳定，应储存在密封容器中，避光;CoCl₂ 溶液的有效期为7天。
3. 准备三氢盐缓冲盐溶液（TBST）。
   1. 准确称取8克氯化钠、0.2克氯化钾和3克三碱。将它们加入 1 L 烧杯中，然后加入 1，000 mL RO 水以溶解混合物。
   2. 将pH调节至7.4，加入1mL吐温20，充分混合，得到TBST溶液。
      注意:吐温20可作为表面活性剂减少抗体与抗原的非特异性结合，在0.1%浓度下效果最佳。
4. 通过在 20 mL PBS 溶液中称取 0.1 g MTT 粉末以获得 5 mg/mL 储备溶液来制备 MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四唑溴化盐）溶液。用0.22μm细菌过滤器过滤溶液，密封，并将其储存在4°C远离光线，待命。
   注意:MTT粉末不稳定，容易吸收水分，因此应存放在密闭干燥处避光。MTT 解决方案将在 7 天后过期。MTT具有致癌作用，因此请避免直接接触皮肤。
5. 通过去除胶囊外壳并准确称取 10 mL DMEM 无糖培养基中的 0.18 g 内容物来制备 Eri 胶囊溶液，以制备 100 μM 储备溶液（基于黄芩的浓度）。用0.2μm细菌过滤器过滤溶液，密封，并将其储存在4°C的密封容器中。
   注意:黄芩素是短黄芩的主要活性成分。胶囊中黄芩素的浓度已通过HPLC-UV测定为2.56mg / g，即5.54μmol/ g⁸。制剂的浓度根据黄芩苷浓度计算。这便于评估制剂和组分的药理活性。
6. 通过在 15 mL 无菌离心管中加入 5 mL 进样液和 5 mL 无糖 DMEM 培养基来制备 Ast 注射液，以制备 60 μM 储备溶液（基于黄芪甲苷 A 的浓度）。通过0.2μm细菌过滤器过滤溶液，并将其储存在4°C的密封容器中。
   注意:每次进样体积为10mL，注射液中黄芪甲苷A的浓度已通过HPLC-ELSD确定为0.094mg / mL（即120μM）⁹。制备工作应在生物安全柜中进行，并在整个过程中以防光方式操作。注射液和无糖培养基的体积应准确测量并充分混合。
7. 通过准确称取7.85 mg黄芪甲苷A标准品并将其完全溶解在2 mL二甲基亚砜（DMSO）中制备黄芪甲苷A溶液，以制备5，000 μM储备溶液。用0.22μm细菌过滤器过滤，并将其密封储存在4°C。
   注意:黄芪甲苷A粉末不溶于无糖培养基。制备溶液时，用适量的DMSO溶解，使DMSO的终实验浓度保持在0.1%以下，以确保无细胞毒性。
8. 通过准确称取11.56mg黄芩素标准品并用5 mL无糖DMEM培养基完全溶解来制备黄芩蛋白溶液，以制备5，000μM储备溶液。用0.22μm细菌过滤器过滤，并将其密封储存在4°C。
9. 通过准确称取8.86mg绿原酸标准品并用5 mL无糖DMEM培养基完全溶解来制备绿原酸溶液，制备5，000 μM储备溶液。用0.22μm细菌过滤器过滤，并将其密封储存在4°C。
   注意:绿原酸粉末不稳定，容易吸水。应密封保存于4°C避光;称重过程中应尽量减少暴露时间。

2. 细胞活力测定

1. 获取 PC12 细胞并在补充有 10% FBS、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素的 DMEM 中培养。
   注意:在本研究中，细胞是从中国科学院获得的。PC12细胞是具有神经内分泌细胞一般特征的贴壁细胞，广泛应用于神经生理学和神经药理学。
2. 在补充有5%CO 2的培养箱中在37°C下培养细胞，并每_2-3 天传代培养一次。在所有实验中使用传代4-8处的细胞。
3. 细胞培养
   1. 用1mL胰蛋白酶（0.25%）处理对数生长期（70%-80%细胞汇合）的PC12细胞，并在显微镜下观察细胞。当细胞变圆时，通过加入 3 mL 的完整培养基停止胰蛋白酶消化。
   2. 将细胞转移到无菌的15mL离心管中，并以840× g 离心细胞5分钟。弃去上清液，用完全培养基重悬，并将细胞悬液转移到 1.5 mL 微量离心管中。然后使用流式细胞仪计数细胞数。
      1. 启动流式细胞术软件，在计数设置中选择细胞溶液的相应稀释倍数，从1.5 mL微量离心管中加载细胞样品后单击 密度图 。
      2. 将细胞群圈出远离 X 轴和 Y 轴，右键单击图下方的数据表，然后选择 X、Y、计数和 Abs 计数。数据表中 Abs Count 下的数据给出了细胞计数结果。
   3. 将细胞浓度调节至1 x 10 5个细胞/ mL，在96孔板中接种100μL /孔，并在培养箱中以37°C和⁵ %CO₂ 培养24小时。
4. 筛选正常PC12细胞上两种药物的安全浓度
   1. 按照步骤2.1-2.2中所述培养细胞。弃去上清液，并用不同终浓度的Ast注射液（4，8，12，16，20和24μM）和Eri胶囊（0.625，1.25，2.5，5，10和20μM）处理正常细胞。处理每组的六个重复孔24小时。
      注意:将药物加入培养基中以达到药物的最终浓度（在步骤2.4.1中提到），然后将等体积的培养基加入到每个孔中。吸出上清液时，移液器吸头应轻轻地靠在孔壁上，以避免接触孔底部的细胞。添加不同溶液时，沿孔边缘轻柔快速地添加，更换移液器枪头时要注意，以免影响实验结果。
   2. 弃去上清液，向每个孔中加入120μLMTT溶液（1mg / mL），并将细胞在37°C孵育4小时。
   3. 孵育后，再次弃去上清液，并向每个孔中加入 150 μL DMSO。使用涡旋振荡器以240次/分钟（每分钟水平振动次数）的速度摇动板10分钟。
   4. 使用酶标仪测量每个样品在490nm处的吸光度。计算细胞活力（%），即处理组的吸光度/正常组（对照）的吸光度x 100。
      注意:确保 MTT 解决方案在有效期内;如果颜色已更改（变为深绿色），则无法使用。测试细胞吸光度时，应设置空白孔（培养基和MTT，不含细胞或药物）以消除其他试剂的干扰。向每个孔中加入150μL的DMSO体积并摇动10分钟以更好地溶解蓝紫色晶体。应尽快检测吸光度，以确保结果的准确性。
5. 筛选损伤PC12细胞上两种药物的有效浓度
   1. 如步骤2.1-2.2所述将细胞培养24小时，弃去上清液，然后用20μL /孔的CoCl₂ （0.4mM）结合无糖培养基处理细胞。
   2. 用100μL /孔的Ast注射液（终浓度为2，6，8，10和12μM）或100μL的Eri胶囊（最终浓度为1，2，3，4和5μM）在37°C下同时处理细胞24小时。向对照组加入 120 μL/孔的完全培养基。
      注意:CoCl₂ 诱导细胞缺氧条件。
   3. 通过MTT方法测量每个样品的吸光度，并按照前面的步骤2.4.2和2.4.3中所述计算细胞活力。
6. 基于均质设计方法的两种药物最优组合筛选
   注:在获得黄芪注射液和短囊的有效浓度范围后，采用统一设计方法U 7（₇ ⁴）表得到两种药物的六种不同组合。阿斯特注射:Eri胶囊:1）2:2.6微米，2）4:5微米，3）6:1.8微米，4）8:4.2微米，5）10:1微米和6）12:3.4微米。
   1. 如上所述在步骤2.3.1中培养细胞，并如上所述用六比例浓度的Ast注射液:Eri胶囊处理受伤的PC12细胞。
   2. 处理细胞24小时并计算细胞活力，如前面的步骤2.4.2和2.4.3中所述。
7. 两种最佳组合对损伤PC12细胞的保护作用评价
   注意:在获得最佳制备组合（Ast注射液:6:1.8μM的Eri胶囊）和最佳组分组合⁷ （10μM黄芪甲苷A，40μM黄芩苷和75μM绿原酸）后，进行进一步评估以检查它们对受伤PC12细胞的保护作用。
   1. 如上所述在步骤2.3.1中培养细胞，并用上述NOTE中讨论的两种类型的药物组合治疗受伤的PC12细胞。
   2. 处理细胞24小时并计算细胞活力，如前面的步骤2.4.2和2.4.3中所述。

3. 膜联蛋白 V-FITC/PI 测定细胞凋亡率

1. 将PC12细胞接种在浓度为1.3 x 10⁵ 个细胞/孔的12孔板中，并在37°C下培养24小时。
2. 细胞分组:对照组、模型组和两种药物组合。向对照组添加 1.2 mL/孔的完全培养基，向模型组添加 1.2 mL/孔含有 0.4 mM CoCl 2 的培养基，并向含有 0.4 mM CoCl 2 的两种组合中各添加_1.2 mL/孔。将细胞在37°C下再孵育24小时。
3. 药物治疗后，用 250 μL/孔胰蛋白酶处理细胞，将细胞转移到 15 mL 离心管中，并在室温 （RT） 下以 840 xg 离心 5 分钟。弃去上清液并将沉淀重悬于500μL结合缓冲液中。
   1. 在室温下用 5 μL 膜联蛋白 V-FITC 和 10 μL 碘化丙啶 （PI） 在黑暗中孵育细胞 15 分钟，然后通过流式细胞术检查细胞凋亡。在每组中设置三个重复孔。
      注意:本测试中使用的胰蛋白酶不能含有EDTA，因为EDTA是一种金属离子螯合剂，与膜联蛋白V竞争结合钙离子并影响膜联蛋白对PI的亲和力。当细胞凋亡发生时，原本位于细胞膜内侧的磷酸丝氨酸向外转向细胞表面，膜联蛋白V-FITC选择性地与膜外的磷丝氨酸结合，显示绿色荧光。
   2. 单击"开始"菜单中的"自动补偿"，在"选择"通道中选择"FITC"、"PE"、"PerCP"和"APC"，然后选择"高度补偿"。在统计项目:中位数中单击确定。使用步骤2.3.2中提到的相同细胞计数方法，收集细胞样本，单击密度图，然后圈出有效细胞群。
   3. 使用 FITC 荧光作为 X 轴参数，将其他荧光参数作为 Y 轴参数，创建密度图。单击"开始"菜单中的"补偿矩阵"和"溢出矩阵中的系数"。显示密度图信息以分析细胞凋亡率。

4. 半胱天冬酶-3生成的免疫荧光检测

1. 将PC12细胞以8 x 10^4个细胞 /盖玻片的密度接种到盖玻片上，并将它们放入37°C的24孔板中24小时。按照上述步骤3.2中提到的对单元格进行分组;为每个组设置三个复制盖玻片。
2. 药物治疗后，用PBS（37°C）冲洗盖玻片两次，每次5分钟，用4%多聚甲醛固定15分钟，并在室温下用0.5%Triton X-100透化20分钟。
3. 再次冲洗细胞，并在室温下用10%山羊血清封闭1小时。
4. 将每个盖玻片与200μL一抗半胱天冬酶-3（细胞凋亡的关键执行蛋白）孵育，在1x TBST中以1:250的浓度稀释，在4°C下过夜。 用 1x TBST（每次 3 次，每次 3 分钟）洗涤，并与 200 μL 二抗（1x TBST 中的 1:300 稀释液）在黑暗中的室温下孵育 1 小时。
   注意:荧光很容易淬灭;因此，在二抗孵育后，载玻片应远离光线。一抗和二抗应储存在4°C避光。
5. 向盖玻片（检测细胞核）中加入 300 μL DAPI （0.5 μg/mL） 10 分钟，并用 1x TBST 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
6. 在荧光显微镜下观察盖玻片并捕获图像¹⁰。使用成像软件对荧光强度进行统计分析。
   注意:使用的载玻片和盖玻片应清洁无菌。染色时，注意染色液的pH值、浓度、温度，避免荧光淬灭。荧光显微镜应至少提前15分钟打开以预热汞灯，并在再次打开之前关闭30分钟。获取图像时，同一批次实验中同一染料的曝光参数应保持一致，以确保结果的准确性。

5. ROS水平的免疫荧光测定

1. 如步骤4.1中所述培养和处理细胞。
2. 药物治疗后，用PBS洗涤每个盖玻片3分钟，并与400μLDCFH-DA（10μM）在37°C孵育20分钟。
   注意:DCFH-DA是氧化应激的通用指标。它具有细胞膜通透性，无荧光。一旦进入细胞，它被酯酶水解产生2'，7'-二氯二氢荧光素（DCFH），然后迅速氧化产生强荧光产物。
3. 用无血清DMEM再次洗涤细胞（每次两次，每次3分钟），并在荧光显微镜下加入荧光淬灭剂后立即观察盖玻片。通过成像软件计算相对荧光强度。
   注意:加载DCFH-DA探头后，请务必清洁未进入电池的残留探头，否则背景会变高。

6. Nrf2、p-Akt、Akt、Bcl-2 和 Bax 11，12 蛋白表达的蛋白质印迹检测

1. 以1 x 10 6细胞/孔的浓度接种6孔板中的PC12^细胞， 并在37°C下培养24小时。如步骤4.1中所述对细胞进行分组和处理，并在每组中设置三个重复孔。
2. 药物治疗24小时后，用PBS洗涤细胞三次，每次5分钟，并在制备的裂解缓冲液中在冰上孵育30分钟。裂解后，将细胞在16，000× g 和4°C下离心20分钟并收集上清液。
3. 检测蛋白质浓度并通过布拉德福德测定根据说明进行调整。稀释样品并在100°C下变性10分钟。
   注意:裂解缓冲液由磷酸酶抑制剂，蛋白酶抑制剂和RIPA裂解物组成，体积比为1:1:50。对照组需要200 μL/孔裂解缓冲液，其他组需要100 μL/孔裂解缓冲液。通常，对照组、模型组和两类组合组的蛋白质浓度分别为0.45 mg/mL、0.25 mg/mL和0.32-0.39 mg/mL;用上样缓冲液稀释后的蛋白质浓度分别为0.36、0.2和0.256-0.312 mg/mL。
4. 要检测具有不同分子量的蛋白质，请在每个泳道中上样 25 μg 蛋白质，运行 12% SDS-PAGE 电泳，然后将凝胶转移到 PVDF 膜上。
   注意:在制备SDS凝胶的过程中，必须充分混合，没有气泡或不溶性颗粒;否则，可能会出现不均匀或不规则的条带。转印膜时，请确保PVDF膜和凝胶之间没有气泡;否则，条带中会出现白点。此外，此步骤必须在低温下进行，并且应每30分钟更换一次冰袋。
5. 用5%脱脂牛奶在室温下封闭膜1.5小时，并与5mL相应的一抗（Nrf 2 1:1，000，Akt 1:2，000，p-Akt 1:2，000，Bcl-2 1:5，000和Bax 1:1，000）在4°C孵育24小时。 使用β-肌动蛋白（1:5，000）抗体作为内部对照。
6. 用TBST洗涤膜（三次，每次10分钟），然后在室温下与5mL二级HPR偶联抗体（1:5，000）孵育2小时。
   注意:抗体的稀释比例不应随意改变，膜应严格按照要求用TBST充分洗涤，以避免条带的背景色太黑。
7. 最后，再次用TBST洗涤膜，并用化学发光HRP底物（按照制造商的说明）处理以进行蛋白质条带检测。使用化学发光成像系统捕获图像，并使用成像软件量化蛋白质的灰度值，β-肌动蛋白作为比较内部对照。

结果

Ast注射液和Eri胶囊的最佳组合的筛选如图1所示。Ast注射液和Eri胶囊在正常PC12细胞上的细胞存活率如图1A所示。浓度大于12μM的Ast注射液（图1A）和浓度大于5μM的Eri胶囊（图1A）的细胞活力低于95%，表明最大无毒浓度分别为12μM和5μM。它们的细胞毒性大于单独使用的黄芪甲苷A和黄芩苷。Ast注射液和Eri胶囊对CoCl...

讨论

现代^{临床实践中}治疗脑缺血的理想药物尚缺乏2.在补气、活血化血法的指导下，Ast、Eri等制剂在中医临床实践中联合使用，取得了良好的综合优势¹³、^14、15。大量研究表明，Ast可以改善血脑屏障的通透性，增加脑血流量，提高神经细胞耐受缺氧和抵抗氧自由基损伤的能力，并能显著改善神经功能障碍

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1300 series class II biosafety cabinet	Thermo Fisher Scientific Instruments Company	1374
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide	Guangzhou saiguo biotech Company	1334GR001	MTT
ACEA NovoExpress 1.4.0	ACEA Biosciences, Inc	-
Akt	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	10176-2-AP
Analytical flow cytometry	Thermo Fisher Scientific Instruments Company	62-2-1810-1027-0
Annexin V-FITC apoptosis detection kit	Beyotime Biotechnology Company	C1062L
Astragalus injection	Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company	A03190612144	Ast injection
Astragaloside A	Chongqing Gao Ren Biotechnology Company	84687-43-4
Bax	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	60267-1-Ig
BCA protein quantification kit	Beyotime Biotechnology Company	P0012
Bcl-2	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	26593-1-AP
Carbon dioxide incubators	Thermo Fisher Scientific Instruments Company	0816-2014
Caspase-3	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	19677-1-AP
Chlorogenic acid	Chongqing Gao Ren Biotechnology Company	327-97-9
Cobalt chloride hexahydrate	Merck Biotechnology, Inc.	7791-13-1	CoCl2
Dimethyl sulfoxide	Guangzhou saiguo biotech Company	2020112701	DMSO
Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate	Chengdu Kolon Chemical Company	2020090101
DMEM high sugar medium	Thermo scientific Hyclone	2110050
DMEM sugar free medium	Beijing Solarbio life sciences Company	2029548
ECL luminous fluid	Lianshuo Biological Company	WBKLS0500
Electronic balance	Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China	FA1204
Electrophoresis instrument	Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd	1658026
Erigeron breviscapus capsule	Yunnan Biogu Pharmaceutical Company	Z53021671	Eri capsule
Fetal bovine serum	Four Seasons Institute of Biological Engineering	20210402	FBS
Fluorescent microscope	Olympms Corporation	IX71-F32PH
Gel imager	Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd	1708265
Goat anti-mouse secondary antibody	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	SA00001-1
Goat anti-rabbit secondary antibody	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	SA00001- 2
IBM SPSS Statistics version 26.0	International Business Machines Corporation, USA	-
ImageJ 1.8.0	National Institutes of Health, USA	-	imaging software
Immunol fluorescence staining kit	Beyotime Biotechnology Company	P0196
KCl	Chengdu Kolon Chemical Company	2021070901
Marker	Thermo Fisher Scientific Instruments Company	26616
Microplate reader	Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co.	HH35L2018296
Motic Inverted microscope	Nanda Scientific Instruments Co.	AE2000LED
NaCl	Chengdu Kolon Chemical Company	2014081301
Nonfat milk	Beyotime Biotechnology Company	P0216
Nrf2	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	16396-1-AP
P-Akt	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	66444-1-Ig
PC12 cells	Chinese Academy of Sciences	CBP60430
Penicillin-Streptomycin solution	Thermo scientific Hyclone	SV30010
Phosphatase protease inhibitor mixture	Beyotime Biotechnology Company	P1045
Potassium dihydrogen phosphate	Chengdu Kolon Chemical Company	2015082901
Reactive oxygen species assay kit	Beyotime Biotechnology Company	S0033S
RI-PA lysis solution	Beyotime Biotechnology Company	P0013B
Scutellarin	Chongqing Gao Ren Biotechnology Company	27740-01-8
SDS-PAGE sample loading buffer, 5x	Beyotime Biotechnology Company	P0015L
Sterile filter tips (0.22 µm)	Merck Biotechnology, Inc.	SLGP033RB
Tris-base	Guangzhou saiguo biotech Company	1115GR500	TBS
Trypsin	Thermo scientific Hyclone	J190013
Tween-20	Chengdu Kolon Chemical Company	2021051301
Vortex oscillator	OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China	VXMNAL
β-actin	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	66009-1-Ig