强粘性水凝胶明胶O-亚硝基苯甲醛的合成

摘要

这里介绍的方案显示了强粘性水凝胶明胶O-亚硝基苯甲醛（明胶-NB）的合成。明胶-NB具有快速高效的组织粘附能力，可以形成强大的物理屏障来保护伤口表面，因此有望应用于损伤修复生物技术领域。

摘要

粘接材料已成为生物医学和组织工程领域流行的生物材料。在我们之前的工作中，我们提出了一种新材料 - 明胶邻亚硝基苯甲醛（明胶-NB） - 主要用于组织再生，并已在角膜损伤和炎症性肠病的动物模型中得到验证。这是一种通过用邻亚硝基苯甲醛（NB）修饰生物明胶而形成的新型水凝胶。明胶-NB通过激活NB-COOH的羧基，并通过1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）与明胶反应合成。将得到的化合物纯化以生成最终产品，其可稳定储存至少18个月。NB对组织上的-NH₂ 有很强的粘附性，可以形成许多C=N键，从而增加了明胶-NB对组织界面的粘附。制备过程包括合成NB-COOH基团、修饰基团、合成明胶-NB和纯化化合物的步骤。目的是详细描述明胶-NB的具体合成过程，并演示明胶-NB在损伤修复中的应用。此外，提出该议定书是为了进一步加强和扩大科学界为更适用的情况制作的材料的性质。

引言

水凝胶是一种由水溶胀形成的三维聚合物。特别是，来源于细胞外基质的水凝胶因其优异的生物相容性和治疗效果而广泛应用于生物合成和再生医学领域¹。水凝胶已被报道用于治疗胃溃疡、神经炎、心肌梗塞^2、3、4 和其他疾病。此外，已经证明明胶-NB可以促进炎症性炎症性肠病（IBD）的结果⁵。传统的水凝胶包括结冷胶、明胶、透明质酸、聚乙二醇（PEG）、层状疏水/亲水、海藻酸盐/聚丙烯酰胺、双网络和多两性水凝胶⁶，均具有良好的组织相容性和机械性能。然而，这些传统的水凝胶容易受到环境中的水分和空气的影响。如果长时间暴露在空气中，会失水变干;如果它们长时间浸泡在水中，它们会吸收水分并膨胀⁷，从而降低它们的柔韧性和机械功能。此外，保持传统水凝胶的组织粘附力是一项重大挑战⁸。

基于此，我们设计并合成了一种纳米级水凝胶明胶-NB，这是一种用NB修饰生物明胶形成的新型水凝胶（图1）。NB对-NH₂ 在组织上的粘附能力很强，可以形成大量的C=N键，从而增加了水凝胶-组织界面的粘附性。这种强的附着力可以使水凝胶牢固地粘附在组织表面，从而形成纳米级的分子涂层。在团队先前的研究中，已经证实这种改性水凝胶涂层提高了组织粘附性⁹;能稳定地粘附在角膜和肠道器官组织上，起到抗炎、屏障隔离、再生促进作用。目的是在这里详细介绍明胶-NB的具体合成过程，让明胶-NB应用于损伤修复的更多场景。此外，我们鼓励其他研究人员进一步加强和扩展这种材料的性质，以适应更多的应用场景。

研究方案

C57BL/6小鼠购自浙江大学医学院邵逸夫医院。新西兰兔是从浙江大学购买的。动物在自然的明暗循环条件下饲养，并自由提供食物和饮用水。所有实验程序均通过浙江大学伦理委员会标准指南（ZJU20200156）和浙江大学医学院邵逸夫爵士医院动物护理和使用委员会的机构指南，符合NIH实验动物护理和使用指南（SRRSH202107106）。

1. NB-COOH的合成

1. 根据^{先前研究中提出的}方案制备 4-羟基-3-（甲氧基-D3）苯甲醛（8.90 g、58.5 mM、1.06 当量）、碳酸钾（10.2 g、73.8 mM、1.34 当量）和 4-溴丁酸甲酯（9.89 g、55.0 mM、1.0 当量）。将化合物溶解在 40 mL 的 N，N-二甲基甲酰胺 （DMF） 中，并在环境温度下搅拌 16 小时。
2. 向混合物中加入200mL的0°C水，使混合物沉淀，得粗品。
3. 将粗品反复溶解在DMF中，然后沉淀五个循环。沉淀粗品，在80°C干燥2小时，得早期产物。

2. 化学改性与加工

1. 如下所述，对4-（4-甲酰基-2-甲氧基苯氧基甲氧基苯基）丁酸甲酯进行ipso取代。
2. 缓慢加入9.4g4-（4-甲酰基-2-甲氧基苯氧基）丁酸甲酯（37.3mM，1当量）到70%硝酸（140mL）的预冷（-2°C）溶液中，并在-2°C下搅拌3小时。
   注意:根据硝化反应的温度，将发生甲酰基部分的当然取代。
3. 用200mL的0°C水过滤混合物（~9.0g），然后在DMF中纯化以沉淀固体产物。
4. 在90°C下将固体产物在三氟乙酸（TFA）/H₂O，1:10 v/v （100 mL）中水解并干燥。除去80kPa以下的溶剂，得到最终中间产物，干燥的淡黄色粉末。
5. 将中间产物（7.4 g、23.8 mM、1.0 eq.） 溶解在四氢呋喃 （THF）/乙醇中，1:1 v/v （100 mL）。然后在0°C下缓慢加入1.43gNaBH₄ （35.7mM，1.5当量）。 3小时后，在真空下除去所有溶剂，并将残留物悬浮在1:1水和二氯甲烷溶液（每个50mL）中。
6. 制备二氯甲烷以从水层中提取产品。除去有机层并用硫酸镁干燥。
7. 使用DCM / MeOH以10:1的比例（1%TEA）通过硅胶柱色谱法纯化粗产物。最后，获得5.31克（18.6mM，78.3%）相对纯的淡黄色粉末NB-COOH。

3. 明胶-NB的合成

1. 准备5克明胶进行一批改性。通过将5g明胶溶解在100mL去离子水中并储存在37°C来制备均匀的明胶溶液。
   注意:这里定义了原始的33 x 10-5摩尔ε^- 氨基/g明胶¹¹ 。
2. 将进料比（FR）定义为明胶中NB基团和伯氨基之间的摩尔比。在这项研究中，53毫克NB和1克明胶被定义为FR_NB = 1。
3. 将 1，060 mg NB-COOH 溶解在 5 mL 二甲基亚砜 （DMSO） 中，以激活 NB-COOH 的羧基。由于NB基团在溶液中对紫外线（UV）敏感，因此请始终使其远离光线。
4. 将746mg的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳酰亚胺盐酸盐（EDC）加入NB-COOH DMSO溶液中，搅拌5分钟。EDC溶解后，加入448mgN-羟基琥珀酰亚胺（NHS）并搅拌5分钟。
5. 使用滴液漏斗以0.5mL / min的速率缓慢地将混合物滴入溶解的明胶溶液中，剧烈搅拌以在45°C下反应4小时。

4. 产品的纯化和储存

1. 将明胶-NB溶液与过量的去离子水透析至少3天，然后收集，冷冻和冻干以获得明胶-NB泡沫。将泡沫放在干燥器中，在黑暗中以备将来使用。
2. 使用前立即将冻干明胶 - NB泡沫溶解在37°C的去离子水中。

结果

图2A 显示了明胶-NB合成中涉及的主要化学反应的示意图，明胶-NB通过将NB基团嫁接到明胶上来促进组织整合。 图2B 显示，明胶-NB水凝胶的O-硝基苯在紫外线照射后立即转化为NB基团，然后活性醛基团可以与氨基交联形成席夫碱。 图2C 表明，不同比例的NB基团会导致明胶-NB的不同交联结构。

同时，还对明胶-NB的?...

讨论

粘接材料是一类新型材料。越来越多的研究人员致力于各类胶粘剂材料的合成，并试图在生物技术、组织工程、再生医学等领域寻找其应用，这导致了近年来的蓬勃发展。除了关注粘合材料的强附着力外，研究人员还更加关注其他性能，如注射性、自愈性、止血性、抗菌性、控制去除等¹³。这些新应用极大地扩大了胶粘剂材料的应用范围，具有广阔的应用前景。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-(3Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimide hydrochloride (EDC)	Aladdin	L287553
4-Hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehyde	Shanghai Acmec Biochemical Co., Ltd	H946072
DCM	Aladdin	D154840
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	20-139
dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	PHR1553
gelatin	Sigma-Aldrich	1288485
magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
MeOH	Sigma-Aldrich	1424109
methyl 4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy methoxyphenyl) butanoic acid methyl ester	chemsrc	141333-27-9
methyl 4-bromobutyrate	Aladdin	M158832
NaBH4	Sigma-Aldrich	215511
N-hydroxysuccinimide (NHS)	Aladdin	D342712
nitric acid	Sigma-Aldrich	225711
potassium carbonate	Sigma-Aldrich	209619
SEM (Nova Nano 450)	Thermo FEI	17024560
THF/EtOH	Aladdin	D380010
trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma-Aldrich	8.0826