离体 聚乙烯醇基培养物中小鼠造血干细胞的扩增和遗传操作

摘要

这里介绍的是使用 离体 聚乙烯醇基扩增启动、维持和分析小鼠造血干细胞培养物的方案，以及通过慢病毒转导和电穿孔进行遗传操作的方法。

摘要

自我更新的多能造血干细胞（HSC）是一种重要的细胞类型，因为它们能够在一生中支持造血并在移植后重建整个血液系统。HSC在临床上用于干细胞移植疗法，代表了一系列血液疾病的治愈性治疗。人们对了解调节HSC活性和造血的机制以及开发新的基于HSC的疗法都非常感兴趣。然而，HSCs离体的稳定培养和扩增一直是在易于处理的离体系统中研究这些干细胞的主要障碍。我们最近开发了一种基于聚乙烯醇的培养系统，该系统可以支持可移植小鼠HSC的长期和大规模扩增以及对其进行基因编辑的方法。该协议描述了通过电穿孔和慢病毒转导培养和遗传操作小鼠HSC的方法。该协议有望对对HSC生物学和造血感兴趣的广泛实验血液学家有用。

引言

造血系统通过专门的血液和免疫细胞类型支持哺乳动物的一系列基本过程，从氧气供应到对抗病原体。需要持续的血液生成（造血）来支持血液系统稳态，而血液系统稳态由造血干细胞和祖细胞（HSPC^）维持1。最原始的造血细胞是造血干细胞（HSC），它具有独特的自我更新和多谱系分化能力^2，3。这是一种罕见的细胞群，主要存在于成人骨髓⁴中，它们以大约每30，000个细胞中一个的频率发生。HSC被认为支持终生造血，并有助于在血液应激后重建造血。这些能力还允许HSC在移植到受辐照的受体后稳定地重建整个造血系统⁵。这代表了HSC的功能定义，也构成了HSC移植疗法的科学基础，HSC移植疗法是一系列血液和免疫疾病的治愈性治疗方法⁶。由于这些原因，HSC是实验血液学的主要焦点。

尽管研究重点很大，但稳定地将HSCs从体外扩增7仍然^{具有挑战性。}我们最近开发了第一个用于小鼠HSC⁸的长期离体扩增培养系统。该方法可以在 4 周培养中将可移植 HSC 扩增 234-899 倍。与其他方法相比，该方案的主要变化是去除血清白蛋白并用合成聚合物代替。聚乙烯醇（PVA）被确定为小鼠HSC培养物⁸的最佳聚合物，现在也已用于培养其他造血细胞类型⁹。然而，最近还发现了另一种名为Soluplus（聚乙烯基己内酰胺-醋酸酯-聚乙二醇接枝共聚物）的聚合物，它似乎可以改善克隆HSC扩增¹⁰。在使用聚合物之前，使用胎牛血清、牛血清白蛋白级分V或重组血清白蛋白形式的血清白蛋白，但这些对HSC扩增的支持有限，仅支持短期（~1周）离体培养⁷。然而，应该注意的是，将HSC保持在静止状态的HSC培养方案可以支持更长的离体培养时间^11，12。

与其他培养方法相比，基于PVA的培养物的一个主要优点是可以产生的细胞数量以及该方案可用于体外跟踪HSC的时间长度。这克服了实验血液学领域的几个障碍，例如每只小鼠可分离的HSC数量少（只有几千个）以及难以在体内随时间追踪HSC。然而，重要的是要记住，这些培养物刺激HSC增殖，而体内HSC池主要处于稳定状态¹³。此外，尽管培养物对HSC具有选择性，但随着时间的推移，其他细胞类型确实会随着培养物而积累，并且可移植HSC在1个月后仅代表约34个细胞中的一个。髓系造血祖细胞似乎是这些HSC培养物中的主要污染细胞类型⁸。然而，我们可以使用这些培养物来富集来自异质细胞群的HSC（例如，c-Kit⁺骨髓HSPCs14）。它还支持用于遗传操作的HSC的转导或电穿孔¹⁴，^15，16。为了帮助从异质培养的HSPC群体中鉴定HSC，CD201（EPCR）最近被确定为有用的离体HSC标志物¹⁰，^{17，18，可}移植HSC仅限于CD201 + CD150 + c-Kit⁺ Sca1 ⁺ Lineage^-部分。

该协议描述了启动，维持和评估基于PVA的小鼠HSC扩增培养的方法，以及使用电穿孔或慢病毒载体转导在这些培养物中进行遗传操作的方案。这些方法有望对一系列实验血液学家有用。

研究方案

所有动物程序，包括繁殖和安乐死，都必须在机构和国家准则范围内进行。下面详述的实验已获得英国内政部的批准。有关本协议中使用的所有材料、试剂和设备的列表，请参阅 材料表 。

1. 准备储备溶液

1. 聚苯乙烯原液解决方案
   1. 取50 mL组织培养质量水放入小玻璃瓶中（适合高压灭菌）。用微波炉将水加热至接近沸腾。
   2. 称出5克PVA粉末，加入水中。
      注意:建议只溶解1-5克PVA。溶解量较大可能导致不完全复溶。
   3. 盖紧盖子并摇匀。然后，松开盖子。
      注意:重新打开时要小心，因为压力可能会因水温变化而变化。
   4. 高压灭菌并冷却。盖紧盖子并摇匀。在无菌管中制作等分试样，并在4°C下储存长达3个月。
2. 将冻干细胞因子溶解在含有 1 mg/mL PVA 的 F-12 培养基中。将干细胞因子复溶至 10 μg/mL，将血小板生成素复溶至 100 μg/mL，以生成 1:1，000 个储备液。在无菌管中制作等分试样，并在-80°C下长期储存。 或者，将等分试样在4°C下储存长达1周。
   注意:避免牛血清白蛋白中细胞因子的重建，因为对小鼠HSC扩增有负面影响。

2. HSC骨髓提取和c-Kit⁺ 富集

1. 解剖刚安乐死的 8-12 周龄 C57BL/6 小鼠的股骨、胫骨、骨盆和脊柱（通过 CO₂ 窒息和/或颈椎脱位），并将骨头放入冰上的 PBS 中。
   注意: 确保表面和工具用 70% 乙醇消毒。
2. 使用不起毛的精致工作湿巾清洁骨骼，去除肌肉和脊髓，并加入含有~3 mL PBS的研钵中。
   注意:确保研杵和研钵用70%乙醇灭菌，然后用PBS冲洗一次。
3. 用研杵碾碎骨头而不研磨，以尽量减少剪切力。使用连接到 5 mL 注射器的 19 G 针头分解释放到 PBS 中的大骨髓碎片。通过 70 μm 过滤器将细胞悬液转移到 50 mL 锥形管中。
4. 转移悬浮液后，用新鲜的PBS重复，直到骨骼漂白并且看不到骨髓。目标是每只小鼠的结束体积为~30 mL，两只小鼠的末端体积为~50 mL。
5. 混合骨髓细胞，收集 10 μL 细胞，并使用 Türks 溶液用血细胞计数器以 1:10-1:20 的稀释度计数。
   注意:一只小鼠预计产生2-5×10⁸ 个全骨髓细胞。
6. 在4°C下以450× g 旋转5分钟，弃去上清液，并将沉淀重悬于冷PBS中（一只小鼠为350μL，两只小鼠为500μL）。
7. 每1000万个细胞加入0.2μL别藻蓝蛋白（APC）抗c-Kit抗体，并在4°C的黑暗中孵育30分钟。
8. 向孵育的细胞中加入 5 mL 冷 PBS 以洗去多余的抗体，并通过 50 μm 过滤器过滤到新鲜的 15 mL 锥形管中。
9. 用 7 mL 冷 PBS 清洗原始管并通过过滤器转移。如果发生过滤器堵塞，请用 P1000 尖端划伤过滤器表面。
10. 在4°C下以450× g 旋转5分钟，弃去上清液，并将沉淀重悬于冷PBS中（一只小鼠为350μL，两只小鼠为500μL）。
11. 每1000万个细胞加入0.2μL抗APC微珠，并在4°C的黑暗中孵育15分钟。 加入 12 mL 无菌 PBS 以洗去多余的微珠。
12. 在4°C下以450× g 旋转细胞5分钟，并重悬于2mL冷PBS中。当单元格在此步骤中旋转时，继续执行步骤 2.13。
13. 通过将磁性过滤柱放入磁性柱分离器的磁铁中来准备色谱柱富集，顶部有一个 50 μm 过滤器，下面有一个 15 mL 锥形管。
14. 通过 50 μm 过滤器和过滤柱运行 3 mL 无菌 PBS。PBS通过后，将细胞悬液通过色谱柱，然后每次洗涤3 mL冷PBS。对于每次洗涤，等待色谱柱停止滴落，然后再添加下一次洗涤。
15. 从磁铁上取下色谱柱，并将其放在新鲜的 15 mL 管顶部。加入 5 mL 冷 PBS，将柱塞安装到色谱柱上，并通过推动柱塞洗脱细胞。
16. 混合富含 c-Kit 的细胞，收集 10 μL 细胞，并使用 Türks 溶液用血细胞计数器以 1:2 的稀释度计数。一只小鼠的典型产量为2-5×10⁶ c-Kit⁺ 细胞。
    注意:此时，可以将细胞直接接种到HSC培养基中或准备用于HSC荧光激活细胞分选（FACS）纯化。

3. 用富含c-Kit的HSPC启动细胞培养

1. 为所需的细胞/孔数准备新鲜培养基（表1）。每毫升接种 0.5-100 万个细胞，用于富含 c-kit 的 HSPC。
2. 旋转富含c-Kit的细胞并以所需的细胞密度重悬于HSC培养基中。
3. 将细胞转移到纤连蛋白包被或负表面带电的板上，每 96 孔板 200 μL 或每 24 孔板 1 mL。
4. 将细胞置于设置为37°C和5%CO₂的组织培养箱中。

4. 用 FACS 纯化的 HSC 启动细胞培养

1. 制备适当体积的生物素化谱系抗体染色剂:每 1000 万个细胞 3 μL 预混液（表 2），在 PBS 中以 1:100 稀释。
2. 旋转富含c-Kit的细胞并在4°C下重悬于谱系抗体染色剂中30分钟。
3. 用10mL无菌PBS洗涤，并在4°C下以450× g 旋转5分钟。
4. 准备适当体积的新鲜HSC抗体染色剂（表3）:每1000万个细胞300μL。除了样品染色外，还要准备适当的染色对照样品以进行补偿和设门。
   注意:使用染料偶联抗体时，在组织培养罩中工作，关灯。
5. 将细胞重悬于HSC抗体染色剂中，并在4°C下孵育90分钟。每20-30分钟通过敲击混合细胞以防止细胞沉淀。
6. 用10mL无菌PBS洗涤，并在4°C下以450× g 旋转5分钟。
7. 吸出上清液，轻弹沉淀以破坏，并用 0.5 μg/mL 碘化丙啶 （PI） 重悬于无菌 PBS 中。
8. 为所需的孔数准备新鲜培养基（表1），并将板放入纤连蛋白或负表面带电板（每96孔板200μL或每24孔板1mL）。
9. 准备FACS机器进行分选，并将CD150 + CD34-c-Kit⁺ Sca1 ^{+ Lineage-HSC}直接分类到含有培养基的孔中（此处使用的标准FACS门控策略参见图1）。每 96 孔板孔最多可分选 200 个细胞，或每 24 孔板孔最多可分选 1，000 个细胞。
   注意:FACS 机器应由训练有素的科学家操作。如果用户没有小鼠HSC的FACS分离经验，建议他们联系当地的FACS设施讨论此分选策略。

5. 执行介质更改

1. 对于从富含c-Kit的细胞开始的细胞培养物，2天后开始更换培养基。对于从 FACS 分离的 HSC 开始的细胞培养物，5 天后开始更换培养基。
2. 为所有孔准备足够的新鲜预热（~37°C）HSC培养基（表1）。
3. 轻轻地从组织培养箱中取出板。
   注意:由于负表面带电板上的HSPC比纤连蛋白上的HSPC更容易受到干扰，因此在更换负表面带电板上的培养基时应格外小心，以免干扰细胞培养。
4. 使用移液器或真空泵，从孔弯月面中缓慢去除~90%-95%的培养基。
   注意:避免从孔的底部抽取培养基，否则许多细胞将被移除。
5. 向孔中加入 200 μL（适用于 96 孔板;1 mL 适用于 24 孔板）新鲜培养基。
6. 将板放回组织培养箱。
7. 每2-3天重复步骤5.1-5.6，直到实验终点。
8. 对于用富含c-Kit的HSPC开始的细胞培养物（第3节），在~3周后以1:2-1:3的比例分裂培养物。对于用FACS纯化的HSC开始的细胞培养物（第4节），在~3周后以1:2-1:3的比例拆分培养物，当培养物>90%汇合时。
   注意:确切的时间表将取决于实验兴趣。这些培养物已被表征了 4-8 周⁸，但可能还有其他培养长度。

6. 电泳培养的HSPC

注意:该协议用于Cas9 / sgRNA核糖核蛋白（RNP）的电穿孔，但可以适用于mRNA或其他重组蛋白的电穿孔。启动具有足够数量细胞的培养物，以便在所需的实验时间点进行此操作。

1. 在电穿孔前1天进行培养基更换，如第5节所述。
   注意:建议在电穿孔前至少进行过夜培养。然而，细胞通常在转导前培养1-3周。
2. 在电穿孔当天，设置核孔器。打开机器。在触摸屏上，选择 X 模块，然后选择使用的 比色皿尺寸 。
3. 为电穿孔的规模准备足够的P3溶液（根据制造商的说明）（每比色皿100μL或每微量比色皿20μL），并使其平衡至室温。
4. 为要接种的孔数准备足够的新鲜培养基（表1），并为24孔板孔添加500μL培养基，或在96孔板孔中加入100μL培养基。
5. 在冰上解冻 sgRNA（在无 RNase 的水中预稀释至 2 μg/mL），并在无菌 PCR 管中将 16 μg sgRNA 与 30 μg Cas9 酶（10 μg/mL）混合。包括一个仅含有Cas9蛋白的额外PCR管作为对照。通过轻弹试管混合，然后短暂向下旋转。在25°C下在热循环仪中孵育10分钟以复合RNP，然后将试管保持在冰上。
   注意:如果在微量比色皿中进行电穿孔，则可以将其缩小五倍。
6. 将用于电穿孔的HSPC混合并转移到管中;收集 10 μL 细胞并使用 Türks 溶液用血细胞计数器以 1:2 的稀释度计数。
   注意:建议每 100 μL 比色皿电穿孔 1-500 万个细胞（微量比色皿按比例缩小五倍）。
7. 在4°C下以450× g 旋转1.5mL管中的适当数量的细胞5分钟。 尽可能多地吸出上清液，并用 100 μL 核转染缓冲液重悬。
8. 立即将细胞悬液转移到含有络合RNP的PCR管中，并缓慢上下移液以轻轻混合并转移到100 μL电穿孔比色皿中。将混合物缓慢地以一个流体运动弹出到比色皿中，以避免在比色皿中形成气泡。
9. 在电穿孔机上，选择被电穿孔孔的位置。使用触摸屏，选择细胞类型程序 CD34⁺， 人类，或输入脉冲代码 EO100。按 确定 按钮。
10. 将比色皿转移到电穿孔器上。按触摸屏上的 "开始" 按钮启动电穿孔。电穿孔后，立即向比色皿中加入 500 μL 培养基（如果使用微量比色皿，则为 100 μL）。
11. 轻轻地将细胞转移到准备好的板中并返回组织培养箱。
12. 对于使用AAV6供体模板的程序，在将细胞转移到浓度为5，000个载体/细胞的纤连蛋白包被板上后立即添加载体。
13. 6-18小时后，准备新鲜培养基并按照第5节所述进行培养基更换。对于这种培养基更换，仅去除80%-90%的培养基。
    注意:避免从孔底部抽取培养基。
14. 2天或更长时间后通过流式细胞术分析细胞（有关详细信息，请参见第8节）。
15. 如第 5 节所述，继续每 2 天更换一次培养基，直到达到实验终点。
    注意:使用这种方法的CRISPR / Cas9的编辑速率高度依赖于设计的sgRNA的靶向效率。通过有效的指南观察到高达 95% 的编辑率¹⁵.sgRNA设计指南之前已在其他地方详述^19，20。

7. 用慢病毒载体转导培养的HSPC

注意:启动具有足够数量细胞的培养物，以在所需的实验时间点执行此操作。

1. 生成并滴定慢病毒载体（取决于实验目标）。在冰上解冻慢病毒载体。
2. 进行介质更换（如第 5 节）;然后，混合并将用于转导的HSPC转移到管中。收集 10 μL 细胞并使用 Türks 溶液用血细胞计数器以 1:2 的稀释度计数。
   注意:细胞可以在电镀后立即转导。然而，细胞通常在转导前培养1-3周。
3. 重新铺板所需剂量的细胞进行转导（通常每 96 孔板 100，000 个细胞）。分别，平板未转导的阴性对照细胞。
   注意:如果使用负表面带电板，请将细胞转移到纤连蛋白包被的平板上进行慢病毒载体转导。
4. 向每个细胞孔中添加慢病毒载体:每个细胞添加20个转导单元，以实现~30%的转导效率。但是，根据实验要求，根据经验确定慢病毒载体剂量。
   注意:确保根据机构指南处理慢病毒载体。
5. 将细胞返回到组织培养箱中6小时。之后，按照第 5 节中所述执行介质更改。
   注意:上清液含有活病毒。根据机构指南进行处理。
6. 2天或更长时间后通过流式细胞术分析细胞（例如，GFP表达）。有关详细信息，请参阅第 8 节。
7. 如第 5 节所述，继续每 2 天更换一次培养基，直到达到实验终点。

8. HSPC培养物的流式细胞术分析

1. 在含有2%FBS的PBS中制备浓缩培养的 离体 HSC抗体混合物（表4）。将混合物在4°C的黑暗中储存长达1个月。
   注意:使用染料偶联抗体时，在组织培养罩中工作，熄灯。
2. 将 2 μL 浓缩抗体混合物加入 50 μL 细胞中。在黑暗中在4°C孵育30分钟。除了样品染色外，还要准备适当的染色对照样品以进行补偿和设门。
3. 加入含有2%FBS的200-1，000μLPBS，并在4°C下以450× g 离心5分钟。 去除尽可能多的上清液，重悬于含有 2% FBS 和 0.5 μg/mL PI 的 100-500 μL PBS 中。
4. 设置流式细胞仪并记录每个样品至少 10，000 个活细胞。
   注意:流式细胞仪应由训练有素的科学家操作。如果用户没有流式细胞术经验，则必须联系当地的FACS设施讨论此分析。
5. 以FCS格式导出数据，并使用适当的流式细胞术分析软件分析数据。有关此处使用的标准门控策略，请参见 图 2 。

结果

对于HSC的FACS纯化，我们预计在富含c-Kit的骨髓中，~0.2%的细胞是年轻（8-12周龄）C57BL / 6小鼠的CD150 + CD34-c-Kit⁺Sca1 ⁺ Lineage^-群体（图1）。然而，转基因小鼠或不同年龄的小鼠可能表现出不同的HSC频率。培养4周后，我们预计CD201 + CD150 + c-Kit⁺ Sca1 ⁺ 谱系^-分数为~10%（图2）。这?...

讨论

我们希望该协议为更普遍地研究HSC生物学，造血和血液学提供有用的方法。自从最初开发用于FACS纯化的HSC⁸的基于PVA的培养方法以来，该方法已经扩展。例如，该方法已被证明适用于富含骨髓的c-Kit和负表面带电板¹⁴。它与转导和电穿孔的相容性也已得到证实^14，15。这些HSC和c-Kit⁺ HSPC培养物的体内验证可...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Dissection kit	Fisher Scientific	12764416
Hemocytometer	Appleton Woods Ltd	HC002
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit	Lonza	V4XP-3024
Pestle and mortar	Scientific Laboratory Supplies Limited	X18000
QuadroMACS separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
Materials
5 mL syringe	VWR International Ltd	720-2519
19 G needle	VWR International Ltd	613-5394
50 μm cell strainer	Sysmex	04-004-2317
70 μm cell strainer	Corning	431751
Kimtech wipes	VWR International Ltd	115-2075
LS MACS column	Miltenyi Biotec	130-042-401
Reagents
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg	IDT	1081058
Animal free recombinant mouse stem cell factor	Peprotech	AF-250-03
Animal free recombinant mouse thrombopoietin	Peprotech	AF-315-14
Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8)	ThermoFisher	17-1171-83
Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8)	Biolegend	105828
Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34)	Biolegend	135040
Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34)	Biolegend	135006
Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2)	Biolegend	115914
Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560)	ThermoFisher	17-2012-82
Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34)	ThermoFisher	11-0341-85
Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5)	Biolegend	100526
Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5)	Biolegend	100508
Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2)	Biolegend	103224
Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2)	Biolegend	103204
Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1)	Biolegend	103428
Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7)	Biolegend	100704
Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7)	Biolegend	100714
Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5)	Biolegend	108424
Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5)	Biolegend	108404
Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7)	Biolegend	108108
Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119)	Biolegend	116223
Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119)	Biolegend	116204
CellBIND plates, 24-well	Corning	3337	negative surface charged
CellBIND plates, 96-well	Corning	3330	negative surface charged
Custom synthetic sgRNA	Synthego, Sigma Aldrich, IDT	Custom order
Fetal bovine serum	Merck Life Science UK Limited	F7524-50ML
Fibronectin Coated plates, 96-well	BD Biosciences	354409
Ham's F-12 Nutrient Mix	Gibco	11765054
Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x)	Gibco	51500.056
Phosphate buffered saline	Alfa Aesar	J61196.AP
Polyvinyl alcohol	Sigma Aldrich	P8136
Propidium Iodide	Enzo Life Sciences (UK) Ltd	EXB-0018
Streptavidin APC/Cy7	Biolegend	405208
Türks’ solution	Sigma Aldrich	109277
Virkon	Mettler-Toledo Ltd	95015662