研究体 外 肠道炎症对已建立的小鼠结肠样的上皮影响

摘要

我们描述了一个协议，详细说明了小鼠结肠隐窝的分离以开发三维结肠。然后，可以在接受炎症激发或被引导建立上皮单层之前对已建立的结肠样蛋白进行终末分化以反映宿主上皮的细胞组成。

摘要

肠上皮在人体健康中起着至关重要的作用，在宿主和外部环境之间提供了屏障。这种高度动态的细胞层提供了微生物和免疫群体之间的第一道防线，并有助于调节肠道免疫反应。上皮屏障的破坏是炎症性肠病（IBD）的标志，对于治疗靶向具有重要意义。三维结肠培养系统是研究IBD发病机制中肠道干细胞动力学和上皮细胞生理学的非常有用的 体外 模型。理想情况下，从动物发炎的上皮组织中建立结肠样体对于评估遗传和分子对疾病的影响最有益。然而，我们已经表明， 体内 上皮变化不一定保留在由急性炎症小鼠建立的结肠样中。为了解决这一限制，我们开发了一种方案，用通常在IBD期间升高的炎症介质混合物来治疗结肠样。虽然该系统可以普遍应用于各种培养条件，但该方案强调对分化结肠和源自已建立的结肠的二维单层的治疗。在传统培养环境中，结肠富含肠道干细胞，为研究干细胞生态位提供了理想的环境。然而，该系统不允许分析肠道生理学的特征，例如屏障功能。此外，传统的结肠样不能提供研究终末分化上皮细胞对促炎刺激的细胞反应的机会。这里介绍的方法提供了一个替代的实验框架来解决这些限制。二维单层培养系统也为 离体治疗药物筛选提供了机会。这种极化细胞层可以用细胞基底侧的炎症介质处理，并伴有假定的治疗方法，以确定它们在IBD治疗中的效用。

引言

炎症性肠病 （IBD） 是一种慢性、缓解和复发性疾病，其特征是炎症发作和临床静止。IBD 的病因是多因素的，但该疾病的关键特征包括屏障功能缺陷和肠上皮通透性增加，此外还有上皮区间内激活的促炎信号级联反应 ^1,2。几种体外和体内模型已被用于概括IBD期间的上皮反应，包括炎症的细胞培养和小鼠模型³。然而，所有这些系统都有重要的缺点，限制了它们在IBD⁴期间概括上皮变化的能力。大多数用于研究IBD的细胞系都是转化的，具有形成单层的能力，并且可以分化³种，但本质上的繁殖方式与宿主中未转化的肠上皮细胞不同。几种不同的小鼠炎症模型用于研究IBD，其中一些包括敲除模型，感染模型，化学炎症模型和T细胞转移模型5,6,7,8。虽然每个人都可以研究IBD的某些病因方面，例如遗传易感性，屏障功能障碍，免疫失调和微生物组，但他们研究疾病的多因素性质的能力有限。

研究方案

本文描述的所有使用小鼠组织的实验均已获得匹兹堡大学机构审查委员会的批准，并根据匹兹堡大学动物研究和护理委员会和 UPMC 制定的指导方针进行。

1. 培养准备

注意：所有试剂都列在 材料 表部分，所有溶液组成都可以在溶液成分表中找到（表1）。

1. 如 表1所述制备小鼠洗涤培养基。在 4°C 下储存长达 2 个月。
2. 如表1所述制备加密隔离缓冲液 1（CIB1）。在 4°C 下储存长达 2 个月。
   注意：二硫苏糖醇 （DTT） 被 OSHA 危害沟通标准认为是危险的，因为摄入可能会产生急性毒性，如果这些区域暴露在它面前，会损害皮肤和眼睛。处理这种化学品时，应使用防护手套、护目镜和面部防护装置。
3. 如 表1中所述制备加密隔离缓冲液2（CIB2）。在 4°C 下储存长达 2 个月。
4. 根据先前发表的方案制备L-WRN条件培养基¹⁶。
5. 如 表1所述制备完整的结肠培养基。完整的结肠样生长培养基可在 4°C 下储存长达 5 天而不会损失活性。
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讨论

类器官的发展彻底改变了科学界在 体外 研究器官系统的方式，能够在培养皿中部分概括动物或人类的细胞结构和功能。此外，源自患有疾病的人类的类器官系统为个性化医疗提供了一种有前途的工具，可以指导治疗决策。在这里，我们描述了一种运行良好的加密隔离协议，并介绍了允许在电镀前清理隔离中多余碎屑的关键步骤。此外，我们还解释了一个在这个过程中经常被忽视的关键细?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4-μM transparent transwell, 24-well	Greiner Bio-one	662-641
15-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-269
50-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-271
70-μM cell strainer	VWR	76327-100
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement	Invitrogen	12587-010	Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVO	World Precision Instruments	STX2
Corning Matrigel GFR Membrane Mix	Corning	354-230	Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-5G	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucose	Thermo Fisher	11960-069	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium	Gibco	14190-144	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA)	Sigma-Aldrich	E7889	Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine Serum	Bio-Techne	S11150H	Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm	Thermo Fisher	12-550-15
G418	InvivoGen	ant-ga-1	Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin Reagent	Gibco/Fisher	15750-060	Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1	Fisher Scientific	35050-061	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 M	Gibco	15630-080	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγ	R&D Systems	285-IF	Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1β	R&D Systems	201-LB	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFα	R&D Systems	210-TA	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide	Sigma	H1009	Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B Gold	InvivoGen	ant-hg-1	Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
mEGF	Novus	NBP2-35176	Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165-5G	Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
Noggin	Peprotech	250-38	Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable	VWR	25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile	Greiner Bio-one	5666-2160
R-Spondin	R&D Systems	3474-RS-050	Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE Express	Thermo Fisher	12604-013	Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water	Invitrogen	10977-023	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride	Abcam	ab120129	Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)