通过反复吸入结晶二氧化硅粉尘建立的矽肺小鼠模型

摘要

该方案描述了一种通过鼻滴反复暴露于二氧化硅悬浮液来建立矽肺小鼠模型的方法。该模型可以高效、方便、灵活地模拟人体矽肺病的病理过程，重复性和经济性高。

摘要

矽肺可由在工业环境中暴露于呼吸性结晶二氧化硅粉尘 （CSD） 引起。人类矽肺病的病理生理学、筛查和治疗都已使用小鼠矽肺病模型进行了广泛研究。通过反复让小鼠将CSD吸入肺部，小鼠可以模仿人类矽肺病的临床症状。这种方法在时间和产出方面是实用和有效的，并且不会因手术而对上呼吸道造成机械损伤。此外，该模型可以成功地模拟矽肺病的急性/慢性转化过程。主要程序如下。将灭菌的1-5μmCSD粉末充分研磨，悬浮在盐水中，并在超声水浴中分散30 min。在异氟醚诱导的麻醉下，小鼠从浅快速呼吸切换到深而缓慢的抽吸约2秒。将鼠标放在手掌中，拇指尖轻轻接触鼠标下颌的唇缘，使气道变直。每次呼气后，小鼠通过一个鼻孔一滴一滴地吸入二氧化硅悬浮液，在4-8秒内完成该过程。在小鼠的呼吸稳定后，抚摸和抚摸它们的胸部，以防止吸入的CSD被咳出。然后将小鼠放回笼子里。总之，该模型可以量化 CSD 沿着微小颗粒进入肺部的典型生理通道，从上呼吸道到末端细支气管和肺泡。它还可以复制员工因工作而经常暴露的情况。该模型可以由一个人执行，不需要昂贵的设备。它方便有效地模拟了人体矽肺病的疾病特征，重复性高。

引言

工人不可避免地会接触到不规则的结晶二氧化硅粉尘 （CSD），这些粉尘可以被吸入，并且在许多职业环境中毒性更大，包括采矿、陶器、玻璃、石英加工和混凝土 ^1,2。一种称为矽肺的慢性粉尘吸入病症会导致进行性肺纤维化³。根据流行病学数据，在过去的几十年里，全球矽肺病的发病率一直在下降，但近年来，它一直在增加并影响年轻人^4,5,6。矽肺病的潜在机制因其隐匿的发病和漫长的潜伏期而对科学研究提出了重大挑战。目前尚不清楚矽肺病是如何发展的。此外，目前没有任何药物可以阻止矽肺病的进展和逆转肺纤维化。

目前用于矽肺病的小鼠模型涉及气管摄入混合 CSD 悬浮液。例如，通过在麻醉后采用颈气管创伤将 CSD 施用于肺部不符合人体反复暴露于染料粉尘⁷.暴露于环境粉尘对个人的影响可以通过以气溶胶的形式暴露于CSD来研究，这更准确地反映了这种^{有毒物质的环境}浓度8。然而，由于小鼠鼻子的独特生理结构，环境性CSD不能简单地直接吸入肺部^9。此外，与该技术相关的设备价格昂贵，这导致研究人员重新评估小鼠矽肺病模型¹⁰。通过在 2 周内通过鼻滴吸入 CSD 悬浮液 5 次，可以建立矽肺病的动态模型。该模型一致且安全，同时易于使用。需要注意的是，这项研究允许小鼠重复吸入CSD。通过该程序创建的小鼠矽肺病模型有望更有利于研究要求。

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研究方案

所有程序均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（NIH 出版物第 8023 号，1978 年修订）的指南，并得到安徽理工大学医学院机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 管理和喂养小鼠

1. 将20只健康的C57BL / 6雄性小鼠以1:1的比例分配到实验组或载体组。使小鼠适应新环境1周。
2. 提供每天 12 小时的恒定光照时间。使用时间控制开关进行精确计时。

2. 准备 CSD 暂停

1. 在滴鼻前至少1天，将二氧化硅在玛瑙研钵中研磨0.5小时。
2. 观察晶体颗粒的大小和形状。使用扫描电子显微镜（SEM）拍摄有代表性的照片。
   1. 使用导电胶带将颗粒粘合在一起，以准备用于SEM的样品。 使用吹风机轻轻吹走粘合不牢固的硅颗粒。
   2. 排空样品室，打开高压，然后捕获图像。
      注意: 使用 SignalA 检测器，镜头和样品之间的工作距离 （WD） 为 5.9 mm，加速电压为 2.0 kV，放大倍率 （Mag） 为 100,000 倍。颗粒以不规则结晶分散，约80%的直径为1-5μm（图1A）。
3. 制备 20 mg/mL 无菌 CSD 悬浮液。使用无菌盐水稀释CSD，并在室温（RT）下将其与超声振荡器（40kHz，80W）混合30分钟。
4. 在给予鼻滴之前，在涡旋混合器上充分搅拌并混合CSD悬浮液10秒。

3. 给小鼠打鼻涕

1. 在麻醉机中以3.6mL / h的剂量用2%异氟醚快速麻醉小鼠（图1B，左图）。
   注意: 麻醉应在通风橱中进行，以避免技术人员吸入麻醉剂。通过观察小鼠从快速和不规则的呼吸到缓慢和稳定状态的变化，确保足够的麻醉深度。
2. 在4-8秒内经鼻滴50μL的CSD（图1B，右）。
   1. 对于鼻滴，用食指尖将小鼠的头部放在研究人员的掌指关节上。
   2. 保持鼠标俯卧位，四根手指微微弯曲，拇指尖轻轻接触鼠标下唇以拉直气道。避免触摸咽部以引起呕吐反射。
   3. 使用200μl移液管吸出50μl液体。根据小鼠的呼吸频率，分三到四次将液体滴入小鼠的鼻腔。每次滴注应由15至20μl液体组成。每 3 天滴一次，12 天内 5 次。用等量的生理盐水处理对照小鼠。
3. 轻轻按摩鼠标的心脏区域 5 次-10 次，持续 5 秒。
   1. 用手掌握住鼠标的身体，用拇指和食指捏住脖子后面的皮肤，用其他手指固定鼠标的后肢。然后，用另一只手的食指在5秒内轻轻按压鼠标的心跳区域5-10次。
4. 当小鼠的呼吸稳定后，将其放入带有加热垫的恢复笼中并观察，直到它从麻醉中恢复过来，然后将鼠标放回其家笼中。在31天时处死小鼠。

4. 收集肺组织并准备石蜡切片

1. 腹膜内注射0.18mL的10%水合氯醛，确保小鼠对脚趾或尾巴刺激没有反应（使用齿形镊子进行）。然后，继续下一步。
2. 将鼠标四肢固定在泡沫测试板上，并喷洒75%酒精以弄湿皮毛。去除锁骨中线的大部分胸肋，打开小鼠的胸腔，露出心脏和肺部。
3. 立即用眼科手术剪刀切开右心房，从左心房跳动处的心脏尖端以最大幅度缓慢注入20mL磷酸盐缓冲液（PBS），使全血流动。接下来，取出右肺的下叶并将其储存在-80°C进行蛋白质印迹分析。
4. 注射 PBS 后，在同一部位灌注 10 mL 4% 多聚甲醛 （PFA）。收集剩余的肺并将样品保存在 30 mL 的 4% PFA 中用于病理分析。
5. 固定72小时后，将标本包埋在石蜡中。
   1. 在室温下，通过在去离子水（60%，70%，80%，90%，100%）中分级的一系列乙醇（EtOH）稀释液使组织脱水1小时。
   2. 通过加热至50°C浸润2小时，用熔化的石蜡渗透样品。在另一个圆柱体中重复此过程。用组织将蜡模冷却1小时以使其硬化。
   3. 蜡硬化并包埋组织后，使用石蜡切片机将组织切片为5μm。前面描述了精确的切片和载玻片安装步骤¹¹。
      注意:在接受 10 mL 4% PFA 后，肌肉抽搐和尾巴扭曲成"S"形或屈曲表明组织灌注充足。

5. 进行苏木精和伊红 （HE） 染色

1. 在热板（60°C）上加热石蜡包埋的组织4小时以上，以使粘附在载玻片上并改善脱蜡。
2. 脱蜡和水合石蜡切片。每次将载玻片与样品在二甲苯中浸泡2次30分钟。接下来，将它们浸入无水乙醇中，然后分别浸入95%、85%、75%酒精和去离子水中5分钟。
3. 进行苏木精和伊红染色。在苏木精染色桶中染色组织10分钟。用轻柔的流水冲洗 5 分钟。然后，将载玻片浸入伊红染色桶中10秒。
4. 将样品在75%，85%，95%和无水乙醇中脱水5分钟。通过将组织切片浸入二甲苯中5分钟来清除组织切片。用大约 60 μL 的中性树脂滴密封切片。将盖玻片放在该部分上并小心地降低它以避免气泡。

6. 进行Masson染色

1. 脱蜡和水合石蜡样品，如步骤5.2所述。然后，用50%Weigert苏木精染色细胞核10分钟。将组织浸泡在酸性乙醇液化中10秒，并用流水轻轻冲洗组织载玻片以使细胞核变蓝。
   注意:使用前立即准备Weigert苏木精染色溶液。
2. 用立春红染色液滴（每个组织载玻片40μL）染色样品7分钟，并用弱酸工作溶液（30%盐酸）洗涤1分钟以除去未结合的立春红染料。
3. 将它们浸入 95% 酒精中 20 秒，然后用无水乙醇脱水 2 次，每次 1-3 秒。之后，用二甲苯清除组织并用 60 μL 中性树脂滴密封，如步骤 5.4 所述。

7. 进行天狼星红染色

1. 脱蜡和水合石蜡切片，如步骤5.2所述。
2. 用天狼星红染色溶液浸润切片1小时。
3. 用Mayer苏木精染色溶液对样品的细胞核染色8-10分钟。用流水轻轻冲洗 10 分钟。然后，脱水并清除组织载玻片。按照步骤 5.4 中的说明密封它们。

8. 进行免疫组化

1. 如步骤5.2所述对石蜡样品进行脱蜡和水合。
2. 用约30mL的3mg / mL EDTA抗原修复溶液浸润标本。煮沸20-30分钟。用去离子水洗涤组织，然后在含有0.5%吐温-20（PBST）的磷酸盐缓冲溶液中孵育5分钟。
3. 用0.3%过氧化氢溶液浸泡样品15分钟，使样品中的内源性过氧化物酶失活。每次用PBST洗涤3次，每次5分钟。
   注意:0.3% 过氧化氢溶液必须在避光环境中新鲜制成。
4. 用0.3%Triton-100溶液透化标本膜15分钟。然后，用30-40μL的5%牛血清白蛋白（BSA）封闭1小时。
5. 去除阻塞溶液。加入稀释的一抗NF-κB（稀释1:200）和CD68（稀释1:1,000），并将标本在2-8°C下在显微镜载玻片IHC湿箱中孵育过夜，以防止蒸发和光照。
6. 第二天，将它们转移到室温下1小时。然后，用PBST洗涤3次，每次5分钟。
7. 在室温下将样品在兔抗小鼠辣根过氧化物酶标记的二抗（稀释比1:500）中孵育1小时，并用PBST 3x洗涤，每次5分钟。
   注:一抗和二抗均用 5% BSA 稀释。
8. 将样品与与酶标记抗体相对应的 3,3'-二氨基联苯胺 （DAB） 底物孵育 5-20 分钟。当达到最佳染色强度时，用去离子水停止反应。
   注意:DAB 溶液需要新鲜制备并避光。显色反应应在显微镜下实时观察，以确定何时停止染色。阳性标本表现出强烈的染色，而阴性标本则不显色。
9. 用Weigert苏木精复染样品30秒。接下来，在流水下冲洗组织1分钟。然后，脱水、清除和密封组织载玻片，如步骤 5.4 所述。

9. 进行蛋白质印迹分析

1. 裂解肺组织以提取蛋白质。将 200 μL RIPA 工作溶液加入 20 mg 肺组织中。
2. 使用手持式电动研磨机将组织在冰上均质化5分钟，并在冰上轻轻摇动孵育1小时。之后，将匀浆在4°C下以14,800× g离心15分钟。
3. 收集上清液并用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白质浓度。用 6 μg/μL 蛋白质的 RIPA 制备蛋白质储存溶液。将 20 μL 的 5x 上样缓冲液加入到 80 μL 的蛋白质裂解物中。通过在金属浴（100°C）中加热含有蛋白质的微量离心管20分钟来破坏二级蛋白质结构。
4. 冷却后，将100μL蛋白质储存溶液分装到每个试管中，并将样品储存在-80°C冰箱中。电泳前用 1x 上样缓冲液将蛋白质浓度稀释至 2–3 μg/μL。
   注意:蛋白质提取过程应在冰上进行。对于 RIPA 工作溶液，将 1 μL 的 100 mM 苯甲基磺酰氟 （PMSF） 加入 99 μL 的 RIPA 中以抑制磷酸化蛋白降解。 通过用RIPA以1:4的比例稀释5x上样缓冲液来制备1x上样缓冲液。
5. 向每个孔中加入 20 μg 样品并运行凝胶。对于 5% 浓缩凝胶，使用 80 V 20 分钟，使蛋白质从相同的起始点电泳。对于10%分离的凝胶，在100V下运行1小时，以尽可能分离不同分子量的蛋白质。
6. 用甲醇预活化PVDF膜20秒。使用湿式转移方法将蛋白质转移到PVDF膜上，电流为400mA，持续1-2小时。
   注意: 确保电泳槽和电转印槽水平。用冰冷却整个水箱，因为膜转移过程会产生大量热量。
7. 每次用TBST溶液洗涤膜5分钟，5次。然后，用5%BSA或5%脱脂牛奶封闭1小时。用 5% BSA 稀释一抗 NF-κB （1:1,000） 和 β-肌动蛋白 （1:1,000）。将条带浸没在抗体溶液中，并在2-8°C下轻轻摇动条带过夜。
8. 用PBST清洗条带。接下来，稀释辣根过氧化物酶（HRP）偶联的山羊抗兔二抗（1:10,000），并在室温下轻轻摇动，将它们在稀释的二抗中孵育1小时。
9. 准备增强化学发光（ECL）显影剂，将其滴在试纸上，孵育3分钟。
10. 将条带暴露于凝胶成像仪 20 秒。测量试纸条的灰度值，通过系统软件评估蛋白质水平。使用β肌动蛋白作为内部对照。

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结果

采用所提方法研究了小鼠矽肺病的潜在发病机制。我们发现，实验组小鼠的体重相对于对照组明显下降，停止暴露后体重恢复缓慢。由于这里使用的优化剂量，在本实验中，在暴露于二氧化硅的小鼠中没有观察到死亡率。反复滴鼻到CSD的技术路线图如图1所示。前面描述的程序包括 CSD 悬吊准备、异氟醚诱导麻醉、鼻滴和胸腔按摩¹²。我们证明了静态喂养 4 ?...

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讨论

矽肺小鼠模型对于研究矽肺病的发病机制和治疗至关重要。该协议描述了一种通过重复鼻腔暴露制备小鼠矽肺病模型的方法。该方法可以研究不同暴露时间引起的矽肺病的病理特征。小鼠在呼吸机上麻醉，并监测它们的呼吸频率。随着时间的流逝，最初的呼吸频率逐渐减慢和加深。麻醉使小鼠的肌肉放松，导致深呼吸，并允许它们在缓慢、深呼吸的时间窗口内吸入CSD。在此过程中，操作者用拇指?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL tube	Biosharp	BS-05-M
10% formalin neutral fixative	Nanchang Yulu Experimental Equipment Co.	NA
Adobe Illustrator	Adobe	NA
Alcohol disinfectant	Xintai Kanyuan Disinfection Products Co.	NA
CD68	Abcam	ab125212
Citrate antigen retrieval solution	biosharp life science	BL619A
DAB chromogenic kit	NJJCBio	W026-1-1
Dimethyl benzene	West Asia Chemical Technology (Shandong) Co	NA
Enhanced BCA protein assay kit	Beyotime Biotechnology	P0009
Hematoxylin and Eosin (H&E)	Beyotime Biotechnology	C0105S
HRP substrate	Millipore Corporation	P90720
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Proteintech	Sa00001-2
Iceacetic acid	West Asia Chemical Technology (Shandong) Co	NA
ImageJ	NIH	NA
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22
Masson's Trichrome stain kit	Solarbio	G1340
Methanol	Macklin	NA
Microtubes	Millipore	AXYMCT150CS
NF-κB p65	Cell Signaling Technology	8242S
Oscillatory thermostatic metal bath	Abson	NA
Paraffin embedding machine	Precision (Changzhou) Medical Equipment Co.	PBM-A
Paraffin Slicer	Jinhua Kratai Instruments Co.	NA
Phosphate buffer (PBS)	Biosharp	BL601A
Physiological saline	The First People's Hospital of Huainan City	NA
Pipettes	Eppendorf	NA
PMSF	Beyotime Biotechnological	ST505
Polarized light microscope	Olympus	BX51
Precision balance	Acculab	ALC-110.4
Prism7.0	GraphPad	Version 7.0
PVDF membranes	Millipore	3010040001
RIPA lysis buffer	Beyotime Biotechnology	P0013B
RODI IOT intelligent multifunctional water purification system	RSJ	RODI-220BN
Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker	Scilogex	NA
SDS-PAGE gel preparation kit	Beyotime Biotechnology	P0012A
Silicon dioxid	Sigma	#BCBV6865
Sirius red staining	Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd.	181012
Small animal anesthesia machine	Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd.	ZL-04A
Universal Pipette Tips (0.1–10 µL)	KIRGEN	KG1011
Universal Pipette Tips (100–1000 µL)	KIRGEN	KG1313
Universal Pipette Tips (1–200 µL)	KIRGEN	KG1212
Vortex mixer	VWR	NA
ZEISS GeminiSEM 500	Zeiss Germany	SEM 500
β-actin	Bioss	bs-0061R