用于映射植物根系架构特征的简单协议

摘要

我们使用简单的实验室工具来检查拟南芥和Medicago的根系结构（RSA）。将小苗水培生长在网眼上，并使用艺术刷展开以露出RSA。使用扫描或高分辨率相机拍摄图像，然后使用ImageJ进行分析以映射特征。

摘要

全面了解植物根系结构（RSA）的发展对于提高养分利用效率和提高作物品种对环境挑战的耐受性至关重要。提出了用于建立水培系统，幼苗生长，RSA传播和成像的实验方案。该方法使用基于洋红色箱的水培系统，其中包含由聚碳酸酯楔块支撑的聚丙烯网。实验设置通过评估不同营养（磷酸盐[Pi]）供应下幼苗的RSA来举例说明。该系统的建立是为了检查拟南芥的RSA，但它很容易适应研究其他植物，如 Medicago sativa （苜蓿）。拟 南芥 （Col-0）幼苗在本次调查中用作了解植物RSA的示例。通过处理乙醇和稀释的商业漂白剂对种子进行表面灭菌，并保持在4°C进行分层。种子在由聚碳酸酯楔块支撑的聚丙烯网上的液体半MS培养基上发芽并生长。将幼苗在标准生长条件下生长所需的天数，从网中轻轻挑出，并浸没在含水的琼脂平板中。在圆形艺术刷的帮助下，将小苗的每个根系轻轻地铺在充满水的盘子上。这些培养皿以高分辨率拍照或扫描以记录RSA性状。根性状，如主根、侧根和分支区，使用免费提供的 ImageJ 软件进行测量。本研究提供了在受控环境环境中测量植物根系特征的技术。我们讨论了如何（1）种植幼苗，收集和传播根样本，（2）获得传播RSA样本的图片，（3）捕获图像，以及（4）使用图像分析软件量化根属性。该方法的优点是可以通用、简单、有效地测量RSA性状。

引言

地下的根系结构（RSA）是植物生长和生产力的重要器官¹，^2，3。在胚胎阶段之后，植物经历了最显着的形态变化。根在土壤中的生长方式极大地影响了地面上植物部分的生长。根系生长是发芽的第一步。这是一个信息性状，因为它对^{不同的可用营养素}做出独特的反应1，²，^3，4。RSA表现出高度的发展可塑性，这意味着环境总是被用来做出有关发展的决策^2，5。在目前的情况下，环境的变化使作物生产更加困难。RSA持续地将环境信号纳入发展选择⁵。因此，彻底了解根系发育背后的原理对于了解植物如何应对不断变化的环境至关重要^2，5。

RSA感知不同的营养浓度，并呈现表型改变⁴，⁶，⁷，⁸，⁹，¹⁰，^11，12。研究表明，与枝条形态相比，根形态/RSA 具有高度可塑性^1，3。RSA性状映射在记录周围^{土壤环境变化}的影响方面非常有效1，^11，12。

一般来说，在许多早期研究中已经报道了各种营养缺乏对根表型的影响的差异³，¹¹，¹³，^14，15。例如，有几个关于磷酸盐 （Pi） 饥饿引起的侧根 （LR） 数量、长度和密度变化的对比报告。据报道，在 Pi 缺陷条件下^6，8 下 LR 密度增加。相比之下，^{其他作者也}报告了在Pi缺陷条件下LR密度的降低3，^13，16。这些不一致的主要原因之一是使用了容易发生元素污染的胶凝培养基，琼脂通常含有¹⁰种。研究人员通常在基于琼脂的平板系统上种植实验植物并记录根性状。许多RSA性状经常隐藏或根深蒂固地存在于琼脂材料中，无法记录。与诱导营养缺乏相关的实验，其中使用者经常从培养基中完全排除一种成分，不能在容易发生元素污染的胶凝培养基^中进行11，^14，15。琼脂培养基中经常大量存在许多营养素，包括P，Zn，Fe以及更多¹¹，^14，15。此外，RSA在琼脂基培养基中的生长速度低于非琼脂基液体培养基。因此，有必要建立一种替代的非琼脂方法，用于定量和定性记录RSA的表型。因此，已经开发了目前的方法，其中幼苗在基于洋红色盒的水培系统中生长，该系统位于由聚碳酸酯楔块¹，^10，11支撑的聚丙烯网之上。

这项研究提出了Jain等人描述的早期方法的详细即兴版本¹⁰。该策略已针对植物根系生物学的当前需求进行了调整，也可用于除模式植物以外的苜蓿等植物。该协议是测量 RSA 变化的主要方法，它只需要简单的设备。本协议说明了如何表型几种根特征，例如正常和修饰培养基（Pi缺陷）中的主根和侧根。提供了从作者的经验中收集的分步说明和其他有用的提示，以帮助研究人员遵循该方法中提供的方法。本研究旨在提供一种简单有效的方法来揭示植物的整个根系，包括高阶LRs。这种方法涉及用圆形水彩艺术刷手动涂抹根系，从而可以精确控制根^部的曝光1，^10，11，12。它不需要昂贵的设备或复杂的软件。这种方法提高了养分吸收和生长速度;植物具有易于被根部吸收的营养丰富的溶液。本方法适用于希望详细绘制植物根系特征的研究人员，特别是在早期发育期间（发芽后10-15天）。它适用于小根系、拟南芥和烟草等模式植物，以及苜蓿等非传统植物，直到它们的根系适合洋红色盒子。

该协议概述了拟南芥中RSA发育的表型分析步骤如下:（1）植物种子表面灭菌的方法（拟南芥），（2）建立水培系统的步骤，然后在培养基上播种，（3）取出完整种子并在培养皿上铺展以进行RSA分析的程序， （4）如何记录RSA的图像，以及（5）使用ImageJ软件计算重要的RSA参数。

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研究方案

图1示意性地总结了整个协议，显示了揭示小苗根系结构（RSA）所涉及的所有基本步骤。协议步骤详见下文:

1.拟南芥种子表面杀菌

1. 将一小勺（约100粒种子=约2.5毫克）种子转移到微量离心管中，并在室温（RT）下在蒸馏水中浸泡30分钟。整个过程在无菌条件下进行。
2. 将含有种子的微量离心管以500 x g 短暂离心5秒，在室温下使用任何台式离心机让种子沉淀下来。
3. 倒出水，加入 700 μL 70% （v/v） 乙醇，涡旋几秒钟，然后旋转。如果需要，重复涡旋和旋转，但确保70%乙醇的处理时间保持在3分钟。
4. 3分钟后，立即用无菌水冲洗一次。保持乙醇洗涤步骤尽可能及时，因为长时间接触乙醇会减少发芽。
5. 用稀释的商业漂白剂（4% v / v）处理种子，滴入吐温-207分钟。通过将试管快速倒置 8-12 次，将种子与漂白剂溶液混合，然后进行短暂的离心机（室温下 500 x g 5 秒）。可以看到泡沫出现在管中。
6. 使用 1 mL 移液管倒出上清液，并按照相同的涡旋程序用无菌水冲洗种子至少五次。
7. 将表面灭菌的种子留在水中，并在4°C下孵育2-3天以进行分层¹⁰。

2. 为种子发芽设置水培系统

1. 用蒸馏水将标准洋红色盒装满一半并高压灭菌。高压灭菌聚碳酸酯板（颜色清晰，质地光滑）并切割4厘米x 8厘米矩形，中点在矩形的一半以上切口，以便两个矩形可以缝合在一起形成X形¹⁰。使用此设置固定从 12x 24 英寸片材上切割的聚丙烯网（6 cm x 6 cm 正方形，孔径为 250 μm，或取决于要求）¹⁰。
   注意:聚丙烯对酸、碱和其他化学品具有很强的耐受性;因此，它已被选择。高压灭菌容易使聚丙烯网变形;因此，建议用铝箔单独包裹。建议使用 16 分钟、121 °C、15 psi 或 775 mm Hg 的典型高压灭菌条件。
2. 如Shukla等人1所述，向每个盒子中加入含有维生素+ 1.5%（w / v）蔗糖的无菌半MS基础培养基，以层流到达聚丙烯网的底部边缘。所有程序均在无菌条件下进行。
3. 将表面灭菌的种子水培在网眼（250μm孔径）上播种，并让它们生长3天。
4. 3天后，将幼苗转移到网状物（500μm孔径）上，让它们生长2天。
5. 2天后（共5天），将幼苗转移到对照培养基上（即^，含有2.0mM NH 4 NO₃，1.9 mM KNO₃，0.15 mM MgSO 4·7H₂O，0.1 mM MnSO₄·H₂O， 3.0 μM 氧化锌 4·7H 2 O， 0.1 μM CuSO 4·5H 2 O， 0.3 mM 氯化钙 2·2H 2 O， 5.0 μM KI， 0.1 μM 氯化钴 2·6H 2 O， 0.1 mM FeSO₄·7H 2 O， 0.1 mM Na 2 EDTA·2H 2 O， 1.25 mM KH ₂PO ₄， 100 μM H 3 BO₃， 1 μM_Na2 MoO₄·2H₂O，1.5%蔗糖，1.25 mM MES，pH 5.7调节用0.1 M MES [pH 6.1]）和实验培养基（例如，P-[0 mM]处理;KH2 PO 4被0.62 mM K₂SO₄取代，从上述¹的对照培养基组合物中取出。对于过量的Pi处理，KH 2 PO₄的浓度在改性MS培养基[_2.5，5.0，10.0，20.0mM]¹）中增加，并使种子生长7天。
   注意:较大的网孔尺寸（500μm）有助于顺利地将整个幼苗采摘出来，而不会损坏或需要在下胚轴处切割。幼苗在标准生长条件下（即16 h光照/8 h暗光周期，150 μmol·^m-2·s-1光强，60%^- 70%湿度）在23 °C下生长。

3. 审查 RSA

1. 准备琼脂（1.1%）平板用于根部铺展（培养皿尺寸:150 mm x 15 mm）。
2. 如上所述，向培养皿中加入10-20mL高压灭菌的过滤自来水。轻轻地从网眼（500μm）中拉出幼苗，并将它们浸入板上的水中。
3. 在圆形水彩艺术刷（尺寸:14、16、18 和 20 号）的帮助下，将每个小苗的根轻轻铺在充满水的盘子中。
   注意:在进行根系的扩散时，首先抓住主根并将其展开成一条直线，因为它用作轴。然后，尽可能将 LR 对称地分布在主根的每一侧。之后，传播链接到一阶LR的二阶LR。这种传播过程是一种艺术;轻轻地，慢慢地做，就像艺术家画RSA的图像一样。
4. 稍微倾斜盘子以除去水。
   注意:此时，可以通过将这些铺板置于4°C来暂停该过程。 稍后，当需要图像处理时，取出板并将其置于室温下一段时间。擦掉冷凝水，然后可以方便地处理图像。

4. 为 RSA 录制图像

1. 适当地扫描或拍摄这些培养皿。
   注意:要获得高质量的照片，建议使用 600 dpi 分辨率进行扫描，建议至少使用 1200 万像素的相机进行摄影。
2. 使用免费提供的 ImageJ 软件 （https://imagej.nih.gov/ij/index.html） 测量根系统架构特征。要快速按照步骤使用 ImageJ 软件测量根长，请参阅示例"测量 DNA 轮廓长度"¹⁷。
   注意:按照以下步骤测量使用高分辨率扫描仪或相机拍摄的照片的根长度。
   1. 使用给定的长度距离来设置比例。 图 3 中比例尺的已知距离为 2 厘米。从 ImageJ 工具栏中选择 "直线 "工具（左起第五个工具）。使用 直线 工具创建轮廓比例尺的线选择。通过右键单击、双击或单击开头的框来完成大纲。
   2. 使用 分析>测量 工具条测量已知比例尺的长度（以像素为单位）。记下像素长度。
   3. 通过单击分析选项卡中的设置比例选项卡打开设置比例对话框。在"以像素为单位的距离"字段中，输入像素长度（如上所述）。接下来，在已知距离字段中，输入值，如比例尺所示（此处为 20 毫米）。将长度单位设置为 mm。像素长宽比为 1.0。现在，比例由每毫米的 x 像素数指定。要锁定此特定图像的比例，请单击"确定"。
   4. 使用分割线工具创建勾勒根长度的 线 选择。通过右键单击、双击或单击开头的框来完成大纲。沿轮廓单击并拖动黑色和白色小"手柄"，以根据需要调整线条选择。
   5. 使用 ImageJ 的"分析"选项卡下的"测量"命令来量化根的长度。要将测量数据传输到电子表格，请右键单击"结果"窗口，从弹出菜单中选择"全部复制"，切换到电子表格，然后粘贴数据。
      注意:如上所述，使用 ImageJ 设置比例选项中比例尺的已知距离设置比例。这给出了每单位长度的像素数。每次分析新图像时，都需要重新设置比例。
3. RSA 性状的测量和计算
   1. 测量下胚轴连接处到根尖末端之间的主根长度。
   2. 测量一阶和二阶 LR 长度。
   3. 测量主根的分支区域 （BZ）。主根 （BZ^PR） 的分支区域跨越第一个 LR 出现点到最后一个 LR 出现点。
   4. 记录 LR 的数量，即源自 BZ^PR 边界内的 LR 数量。
   5. 测量一阶和高阶 LR 的平均长度。 通过将 1° LR 的总长度除以 1° LR 的总数来得出一阶 LR （1° LR）（每根厘米）的平均长度。
   6. 测量二阶 LR 的平均长度。通过将 2° LR 的总长度除以 2° LR 的总数来计算二阶 LR （2° LR） 的平均长度。
   7. 测量 1° LR 密度。通过将 1° LR 的数量除以 BZ^PR 的长度来计算 1° LR 密度（BZ^PR 单位长度 1° LR 的数量）。
   8. 测量 2° LR 密度。通过将 2° LR 的数量除以 1° LR 的 BZ 长度（1° 侧根的 BZ 每单位长度的 2° LR 数）来计算 2° LR 密度。
   9. 测量总根长度 （TRL）。这是主根、1° LR 和 2° LR（如果存在更多）长度的总和。

5. 根毛测量

注意:尽管水培系统不擅长促进根毛的生长和发育，尽管它在固体生长培养基中一样健壮，但在目前的情况下研究它仍然很重要。按照以下步骤分析从幼苗主根尖端开始的 5 毫米截面的根毛发育。

1. 从根尖切掉主根的 2 厘米部分。
2. 使用10%甘油作为安装介质将根部安装在载玻片上。
3. 将载玻片放在体视显微镜下。
4. 使用轴向载体可视化和捕获根毛的图像。
5. 如前所述，使用ImageJ软件分析图像以研究根毛的结构和特征。

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结果

使用简单的实验室工具测量根系结构（RSA）的不同形态特征，步骤示意性地描述在 图1中。水培设置的细节证明了该方案在测量RSA方面的潜力（图1 和 图2）。

鉴于观察到的胶凝剂差异，我们使用水培生长系统进行所有研究^3，10。作为概念证明，这种水培系统运行良...

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讨论

这项工作演示了使用简单的实验室设备绘制RSA的地图。使用这种方法，在精细水平上记录表型改变。这种策略的好处是芽部永远不会与培养基接触，因此小苗的表型是原始的。该方法涉及建立水培系统以按照协议中所述种植幼苗。然后，将每个幼苗完整取出并放置在充满琼脂的培养皿上。然后允许使用艺术刷手动涂抹根系，并拍摄照片以使用ImageJ软件¹，¹⁰，

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arabidospsis thaliana (Col 0)	Lehle Seeds	WT-02	Columbia (Col-0**, no markers)*
Art brushes	Amazon or any other vendor		Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm)
Automated Microscope with digital camera	Leica Microsystems		LAS version 4.12.0, Leica Microsystems
Imaging Software	ImageJ		ImageJ V  1.8.0
Magenta box GA-7	Fisher Scientific	50-255-176
Medicago sativa	Johnny's Seeds
Petri-plate (150 mm x 15 mm)	USA Scientific	8609-0215	150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com)
Photo camera	Cannon or Nikon		Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode
Plant-Agar	Sigma-Aldrich	A3301	Agargel  Suitable for plant tissue culture
Polycarbonate Sheets	Amazon		1 mm  thick
Polypropylene Mesh	Amazon		Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm
Scanner	Epson		Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi)