患者来源乳腺类器官的建立和培养

摘要

这里提供了一个详细的方案，用于从患者来源的乳腺肿瘤切除术或正常乳腺组织中建立人乳腺类器官。该协议为培养、冷冻和解冻人类患者来源的乳腺类器官提供了全面的分步说明。

摘要

乳腺癌是一种复杂的疾病，已分为几种不同的组织学和分子亚型。我们实验室开发的患者来源乳腺肿瘤类器官由多个肿瘤来源的细胞群的混合物组成，因此比已建立的2D癌细胞系更近似于肿瘤细胞多样性和环境。类器官是一种理想的 体外 模型，允许细胞 - 细胞外基质相互作用，已知在细胞 - 细胞相互作用和癌症进展中起重要作用。患者来源的类器官也比小鼠模型具有优势，因为它们是人类来源的。此外，它们已被证明可以概括患者肿瘤的基因组、转录组和代谢异质性;因此，它们能够代表肿瘤的复杂性以及患者的多样性。因此，他们准备为靶标发现和验证以及药物敏感性测定提供更准确的见解。在该协议中，我们详细演示了如何从切除的乳腺肿瘤（癌症类器官）或还原性乳房整形术衍生的乳腺组织（正常类器官）中建立患者来源的乳腺类器官。接下来是3D类器官培养，扩增，传代，冷冻以及患者来源的乳腺类器官培养物的解冻的全面说明。

引言

乳腺癌 （BC） 是女性中最常见的恶性肿瘤，据估计，2022 年美国将诊断出 287，850 例新病例¹.尽管最近在早期发现方面取得了进展，包括年度筛查、靶向治疗和更好地了解遗传易感性，但它仍然是美国女性癌症死亡的第二大原因>，每年有 40，000 人死于乳腺癌¹。乳腺癌目前根据原发肿瘤的组织病理学和分子学评估分为多种亚型。更好的亚型分层通过亚型特异性治疗方案改善了患者的预后².例如，将HER2鉴定为原癌基因³导致了曲妥珠单抗的发展，这使得这种高度侵袭性的亚型在大多数患者中易于控制⁴。以患者特异性方式进一步研究这种复杂疾病的遗传学和转录组学将有助于开发和预测更好的患者特异性个性化治疗方案^2，5。患者来源类器官（PDO）是一种很有前途的新模型，可以在分子水平上深入了解癌症，确定新的靶点或生物标志物并设计新的治疗策略⁶，^7，8。

PDO是源自新鲜切除的原代组织样本的多细胞三维（3D）结构^8，9。它们通过嵌入水凝胶基质（通常由细胞外基质（ECM）蛋白的组合组成）进行三维生长，因此可用于研究肿瘤细胞 - ECM相互作用。PDO代表患者的多样性，并概括了肿瘤的细胞异质性和遗传特征¹⁰，^11，12。作为体外模型，它们允许基因操作和高通量药物筛选¹³，^14，15。此外，PDO可以合理地用于评估患者的药物敏感性和与临床平行的治疗策略，并帮助预测患者结果¹⁶，^17，18。除化疗外，某些类器官模型也已用于检查个体患者对放化疗的反应^19，20。鉴于PDO在研究和临床应用中的可喜应用性，美国国家癌症研究所发起了一个国际联盟，即人类癌症模型倡议（HCMI）²¹，以生成和提供这些肿瘤衍生的新型癌症模型。通过HCMI开发的各种癌症类型的许多类器官模型可通过美国类型培养物保藏（ATCC）^获得22。

正常的乳腺类器官已被证明由乳腺中存在的不同上皮细胞群组成¹¹，²³，因此可以作为研究基本生物学过程，分析导致肿瘤发生的驱动突变以及癌细胞起源谱系研究的重要模型^6，15.乳腺肿瘤类器官模型已被用于识别新的靶点，这些靶点正在鼓励开发新疗法的前景，特别是对于耐药肿瘤²⁴，^25，26。Guillen等人使用患者来源的异种移植物（PDX）和匹配的PDX衍生类器官（PDxO）模型对难治性乳腺肿瘤进行研究，表明类器官是精准医学的强大模型，可用于评估药物反应和平行指导治疗决策²⁸。此外，开发用于培养具有各种免疫细胞²⁷，²⁸，²⁹，成纤维细胞^30，31和微生物^32，33的PDO的新共培养方法为研究肿瘤微环境对癌症进展的影响提供了机会。虽然许多此类共培养方法正在积极用于胰腺或结直肠肿瘤的PDO，但类似的乳腺PDO共培养方法仅在自然杀伤细胞³⁴和成纤维细胞³⁵上报道。

代表不同乳腺癌亚型的>100个患者来源类器官的第一个生物库由Hans Clevers小组^36，37开发。作为这项工作的一部分，Clevers小组还开发了第一个用于乳腺类器官生长的复杂培养基，目前广泛使用³⁶。一项后续研究全面介绍了乳腺PDO和患者来源的类器官异种移植物（PDOX）的建立和培养情况³⁸。Welm实验室开发了大量BC PDX模型和PDxO，这些模型和PDxO在含有胎牛血清（FBS）和较少生长因子^39，40的相对简单的生长培养基中培养。我们独立开发和表征了大量幼稚的患者来源的乳腺癌类器官模型¹¹，并参与了BC PDO模型的开发，作为HCMI计划²¹的一部分。在这里，我们旨在提供一份实用指南，详细说明我们在生成患者衍生的乳腺类器官模型系统时采用的方法。

研究方案

根据机构审查委员会协议IRB-03-012和IRB 20-0150，并在患者的书面知情同意下，从Northwell Health获得了乳腺癌患者的肿瘤切除以及远端和邻近正常组织。

注意:经生物安全委员会批准，以下提到的所有程序均在指定用于患者样本的哺乳动物组织培养BSL2室中进行。所有程序应按照安全规程执行，以保持生物安全柜中的无菌条件。除非另有说明，否则每个离心步骤均在室温（RT）下进行。除非另有说明，否则组织/类器官和基底膜基质原液始终放在冰上。将新板孵育过夜以进行预热。 预热板上的电镀圆顶可确保获得最佳效果，以获得圆形圆顶，这些圆顶在电镀或稍后从板表面抬起时不会变平。

1. 培养基制备和配方

1. 如下所述制备R-spondin1条件培养基（也可以商业购买）。
   1. 准备两种独立的生长培养基，由 Dulbecco 的改良 Eagle 培养基 （DMEM）、10% FBS、5% 青霉素-链霉素组成，并添加或不添加 300 μg/mL 沸蛋白。
   2. 在装有15mL培养基的75cm² 组织培养瓶中解冻一瓶HEK293T-HA-Rspondin1-Fc细胞（从斯坦福大学的Calvin Kuo实验室获得，也可市售）。
   3. 将细胞分成 2 x 175 cm² 个培养瓶中，每个培养瓶装有 35 mL 含有沸蛋白的培养基。
   4. 再次传代细胞以获得产生所需批次的R-spondin1条件培养基所需的尽可能多的烧瓶。使用不含沸石的生长培养基。
   5. 当含有不含沸蛋白的培养基的烧瓶汇合时，除去并用Ad-DF+++替换生长培养基（步骤1.2; 表 1）。将细胞置于含有5%CO₂ 的37°C培养箱中1周。
   6. 以400 x g 离心培养基5分钟以去除任何未附着的细胞。通过0.22μm过滤器过滤介质。制作25mL等分试样并将其储存在-20°C（可储存长达6个月）。
   7. 使用HEK293T细胞，使用商业DNA转染试剂以4.8:1的试剂与DNA比例与稀释剂DMEM（高葡萄糖，丙酮酸）进行双荧光素酶TOPFLASH^41，42 测定。将 100 μL R-spondin1 条件培养基（或阴性对照的基础培养基）加入 100 μL 转染细胞中。然后，按照制造商的方案进行双荧光素酶测定，以验证R-spondin1条件培养基的Wnt活性。
      注意:该测定使用具有萤火虫荧光素酶活性读数的TOP质粒，并将FOP质粒用作阴性对照。
2. 准备基础培养基（Ad-DF+++培养基，如Sachs等人之前发表的³⁶）。

   试剂	库存集中度	最终浓度
   高级 DMEM/F12	1 倍	1 倍
   谷氨酸最大值	100 倍	1 倍
   赫佩斯	2 .	10 毫米
   青霉素-链霉素	10，000 U/毫升;10，000微克/毫升	100 U/毫升;100微克/毫升

   
   表1:基础Ad-DF+++培养基组成。
3. 为患者来源的乳腺类器官制备完整的培养基，如Sachs等人之前发表的³⁶所示。

   试剂	库存集中度	最终浓度
   广告-DF+++ 培养基	1 倍	1 倍
   R-斯庞丁内部	100%	10%
   B-27补充	40年期	1 倍
   烟 酰 胺	0 升	5 毫米米
   国家行动委员会	500 毫米	1.25 毫米
   普利莫星	50毫克/毫升	50微克/毫升
   诺金	100微克/毫升	100 纳克/毫升
   人类EGF	5 微克/毫升	5 纳克/毫升
   人赫雷古林β1/神经调节素1	75微克/毫升	37.5纳克/毫升
   Y-27632 二盐酸盐（Rho-激酶）	100 毫米	5 微米
   A83-01	5 毫米米	500 纳米
   人类FGF-7	100微克/毫升	5 纳克/毫升
   人类FGF-10	1毫克/毫升	20 纳克/毫升
   P38i	30 毫米	498 纳米

   
   表2:患者来源的乳腺类器官的完整培养基组成。
4. 通过称量所需量的胶原酶IV粉末并将其溶解在Ad-DF + ++基础培养基中，制备2 mg / mL胶原酶IV溶液。使用前通过0.22μm过滤器过滤。
5. 使用 1x Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 作为稀释剂，从 7.5% 储备溶液中制备 0.5% 牛血清白蛋白 （BSA） 溶液。使用前通过0.22μm过滤器过滤。

2. 从切除组织中建立乳腺肿瘤/正常类器官（图1）

1. 将手术切除的乳腺肿瘤/正常组织标本在含有Ad-DF+++的50 mL锥形管中运送到实验室。将试管存放在冰上，直到隔离开始。
2. 在冰上解冻一瓶基底膜基质或在4°C下过夜。
3. 将切除的组织转移到10厘米无菌培养皿中。肉眼检查组织，并注意其形态上是否有脂肪、血管化或坏死。此外，记录组织的大小和形状。理想情况下，用尺子拍摄组织的照片（图2）。
4. 用无菌 10 号手术刀将组织切成非常小的碎片 （~1 mm³），然后将其转移到 50 mL 锥形管中。
5. 加入 10 mL 2 mg/mL 胶原酶 IV 溶液，并用透明薄膜密封试管。将管子放在37°C以140rpm的轨道振荡器上，以倾斜位置（~30°角）放置30-90分钟。
6. 在孵育期间，将等分试样的完全培养基置于37°C珠子/水浴中预热。
7. 每 15 分钟，使用 5 mL 无菌血清移液管剧烈上下混合来重悬组织。用0.5%BSA溶液预涂移液器，以防止样品粘在移液器上导致组织损失。通过在显微镜下以5倍或更高的放大倍率观察锥形管来监测随时间推移的解离。
8. 一旦组织解离，以400× g 离心5分钟。吸出上清液，加入 10 mL Ad-DF+++，并以 400 x g 离心 5 分钟。
9. 小心丢弃上清液。组织颗粒偶尔会松散，因此在吸液时要小心。再次重复该步骤。
10. 如果组织沉淀部分红色，则加入 2 mL 红细胞裂解缓冲液并在室温下孵育 5 分钟。不要孵育更长时间，因为这会显着降低细胞活力。
11. 向管中加入 10 mL Ad-DF+++，以 400 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。将沉淀重悬于 50-300 μL 未稀释的冷基底膜基质中，并通过仔细移液混合以避免形成气泡。
    注意:添加的基底膜基质的体积取决于颗粒尺寸。如果不确定，请从重悬沉淀中板~10μL的小圆顶，并在显微镜下观察汇合度。如果需要，通过添加更多的基底膜基质进行调整。参考 图3 （第1天图像）了解参考接种密度。
12. 在预热、标记的 6 孔组织培养板的每个孔中板 300 μL 含有类器官的基底膜基质圆顶。如果使用不同的板，请参阅 表 3 了解推荐的基底膜基质和中等体积。

    每板孔数	每个圆顶的基底膜基质 （μL）	每孔培养基（μL）
    6	300	3000
    12	100	1000
    24	50	500
    48	25	250
    96	10（悬架代替圆顶）	100

    
    表3:基于板尺寸的每孔推荐的基底膜基质和生长培养基的量。
13. 将板在罩中不受干扰5分钟，然后小心地置于37°C的培养箱中20-30分钟，以使基底膜基质圆顶完全凝固。
14. 将 3 mL 预热的完全培养基滴加到 6 孔板的每个孔中，并置于 37 °C 和 5% CO₂ 的培养箱中。在倒置明场显微镜上使用5倍物镜拍摄类器官图像。
15. 根据类器官的生长情况，每4-8天补充一次培养基。小心地吸出旧培养基而不干扰圆顶，并滴加新鲜的预热培养基。
    注意:该方案与建立源自切除肿瘤的乳腺癌类器官和源自切除的健康乳房组织的正常类器官（来自同一患者的相邻和正常乳房组织或从复位乳房整形手术获得的健康乳房组织）的正常类器官相同。

3. 在培养中传代和扩增患者来源的乳腺类器官

1. 在冰上解冻一瓶基底膜基质或在4°C下过夜。
2. 使用细胞刮刀或 1 mL 移液器吸头将基底膜基质圆顶提升到孔中的培养基中。
3. 用 0.5% BSA 溶液预涂住移液器吸头，然后将类器官的浮动圆顶与培养基转移到 15 mL 或 50 mL 锥形管中，具体取决于收获的孔数。对于含有 300 μL 基底膜基质圆顶的两个以上孔，请使用 50 mL 锥形管。添加 1x DPBS 以将体积增加到至少 5 mL。
4. 以400× g 离心管5分钟。带有类器官的基底膜基质在底部形成一层。小心吸出以除去上清液。
5. 加入 5-20 mL 的 1x DPBS，具体取决于管中汇集的孔数。用0.5%BSA预涂无菌一次性移液器，并通过上下移液将类器官基底膜基质沉淀均匀地混合在DPBS中。
6. 以400× g 离心管5分钟。小心吸出并丢弃上清液。
7. 将基底膜基质体积的三倍的细胞解离试剂添加到管中。使用0.5%BSA包被的移液器吸头，将类器官重悬于细胞解离试剂中。
8. 将管子放在37°C以140rpm的轨道振荡器上倾斜8-15分钟。每5分钟在显微镜下观察一次管子，以确保类器官被分解成更小的簇。
9. 以等于或大于细胞解离试剂的体积加入基础培养基（即Ad-DF+++），并移液以混合类器官。在室温下以400× g 旋转5分钟以获得类器官沉淀。
10. 如果沉淀含有仍嵌入未溶解的基底膜基质中的类器官，则重复步骤3.7-3.9再进行5-8分钟的胰蛋白酶消化。
11. 获得没有未溶解基底膜基质的白色类器官沉淀后，弃去上清液，并加入 1 mL Ad-DF+++ 以通过移液重悬沉淀。然后添加更多 Ad-DF+++，最多 10 mL。
12. 在室温下以400× g 旋转5分钟以进行洗涤步骤。吸出并丢弃上清液。
13. 根据适当的分流比将所需量的基底膜基质添加到消化的类器官中（对于基于生长速率的每个类器官系，这将有很大差异）。有关播种密度的示例，请参阅 图 3 （第 1 天图像）。通过轻轻上下移液混合，以避免产生气泡。立即放在冰上。
14. 打开并标记预热的 6 孔板。建议在孔的角落里镀一个10-20μL的圆顶，以观察显微镜下的汇合度。如果类器官汇合，可以添加更多的基底膜基质以增加分流比。
15. 板 300 μL 类器官圆顶重悬于基底膜基质中。确保在电镀多个孔时将管保持在冰上，以使基底膜基质保持在溶液中。
16. 将板在罩中不受干扰5分钟，然后小心地置于具有5%CO₂ 的37°C培养箱中，而不会干扰圆顶。
17. 20-30分钟后，圆顶凝固。向每个孔中加入 3 mL 预热的完全培养基，并将板放回培养箱中。每5-7天加入新鲜的完全培养基。对培养物进行常规检测以检测支原体污染。
    注意:乳腺肿瘤和正常类器官培养的方案是相同的。然而，根据我们的经验，正常的类器官倾向于在减速之前生长到第6-8代。建议为将来的研究制作尽可能多的早期传代库存。

4. 冷冻患者来源的乳腺类器官

1. 通过类器官的汇合孔以除去任何基底膜基质，如步骤3.1-3.12中所述。
2. 传代前，每 200-300 μL 基底膜基质体积中用 1 mL 培养基重悬类器官沉淀（在 4 ºC 下解冻过夜）。冷冻前进行细胞计数以供参考。如果需要，等分少量（至少 100 μL）细胞以进行进一步胰蛋白酶消化以获得单个细胞，然后使用细胞计数器对其进行计数。
3. 将 1 mL 细胞转移到标有类器官行号、日期和传代号的 2 mL 冷冻管中。确保用永久性标记标记试管或使用冷冻标签。
4. 将小瓶移至细胞冷冻容器中，并将容器转移到-80°C冰箱中。孵育过夜后，将小瓶准备移至液氮储存冰箱进行长期储存。

5. 解冻患者来源的乳腺类器官

1. 在冰上解冻一瓶基底膜基质或在4°C下过夜。 在37°C下预热Ad-DF+++培养基。 将 9 mL 预热培养基等分到每个冷冻小瓶的 15 mL 锥形管中。
2. 通过将类器官冷冻瓶放入37°C珠浴中快速解冻类器官。喷洒70%乙醇并将管转移到生物安全柜中。
3. 用0.5%BSA溶液冲洗移液器吸头，以避免类器官丢失。通过上下移液轻轻混合解冻的类器官，以混合管中的任何沉淀类器官。
4. 以滴加方式将 1 mL 冷冻类器官轻轻转移到 9 mL 预热的 Ad-DF+++ 中。以400× g 旋转细胞5分钟，然后小心地弃去上清液。
5. 通过在类器官沉淀中加入 10 mL 新鲜预热的 Ad-DF+++ 来洗涤沉淀，并用预涂有 0.5% BSA 的移液管轻轻混合以重悬沉淀。以400× g 旋转细胞5分钟，小心地弃去上清液。
6. 将类器官沉淀放在冰上，并使用较小体积的移液器吸头小心地去除任何残留的Ad-DF+++。将沉淀重悬于 300 μL 基底膜基质中，并将板置于预热的 6 孔板中。将板置于含有5%CO₂的37°C培养箱中。
   注意:建议从重悬沉淀中将一个小的10μL圆顶板放在孔的一角，以在显微镜下辨别汇合度。如果类器官看起来汇合，则通过加入 300 μL 基底膜基质进行稀释，以将其接种到 6 孔板的两个孔中。
7. 孵育20-30分钟后，向凝固的圆顶中加入3mL预热的完全培养基。

结果

我们已经建立了一个患者来源的乳腺肿瘤类器官的生物库，包括各种亚型¹¹。此外，我们使用 图1中概述的方法建立了多个来自还原性乳房整形组织样本或BC患者的相邻/远端正常乳房的正常类器官系。

各种患者来源的乳腺肿瘤类器官系在其形态（图2）和生长速率（图3）上有所不同。正常的?...

讨论

我们的实验室已成功采用上述方案从幼稚的肿瘤切除或刮片中建立类器官。我们还利用该协议从通过复位乳房成形术 获得 的乳腺组织或癌症患者的邻近或远端正常乳腺组织中开发正常类器官。约30%-40%的切除原发性肿瘤导致长期（>传代8）肿瘤类器官培养成功。在几次传代后逐渐变细的肿瘤类器官系要么具有正常类器官或基质细胞的生长，要么主要由非增殖性肿瘤细胞组成。进一步评估和?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical tubes	VWR	525-1068
175 cm2 tissue culture flask	VWR (Corning)	29185-308
37 °C bead bath
37 °C CO2 incubator
50 mL conical tubes	VWR	525-1077
50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter)	Millipore Sigma	SCGP00525	SCGP00525
500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter	Nalgene	566-0020
6-well culture plates	Greiner Cellstar	82050-842
75 cm2 tissue culture flask	VWR (Corning)	29185-304
96-well opaque plates	Corning	353296	For CTG assay
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
B-27 supplement	Life Technologies	12587010
BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader	Fisher Scientific (Agilent)		For dual luciferase assay and CTG assay
BSA fraction V (7.5%)	Thermo Fisher	15260037
Cell Titer-Glo (CTG) Reagent	Promega	G9683	luminescent cell viability assay
Centrifuge	Eppendorf	5804
Collagenase from Clostridium histolyticum	Millipore Sigma	C5138	Type IV
Cryolabels	Amazon	DTCR-1000	Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5"
Cryovials	Simport Scientific Inc.	T311-1
Countess 3 Automated Cell Counter	Thermo Fisher	AMQAX2000
DMEM, high glucose, pyruvate	Thermo Fisher (Gibco)	11995040
Dual Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1910
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X)	Gibco	14190-144	DPBS
Epidermal growth factor (hEGF)	Peprotech	AF-100-15
Fetal Bovine Serum (FBS)	Corning	35-010-CV
FGF-10 (human)	Peprotech	100-26
FGF-7/KGF (human)	Peprotech	100-19
GlutaMax	Life Technologies	35050061
HEK293T cells	ATCC	CRL-3216	For TOPFlash Assay
HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells	R&D Systems	3710-001-01	Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells
HEPES	Life Technologies	15630-080
Heregulinβ-1 (human)	Peprotech	100-03
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (~10 mg/mL protein concentration)	Corning	356231	Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix
Mr. Frosty Cell Freezing Container	Thermo Fisher	5100-0001
Mycoplasma detection kit	Lonza	LT07-418
N-acetyl-l-cysteine	Millipore Sigma	A9165
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes	Thermo Fisher	166-0045
Nicotinamide	Millipore Sigma	N0636
Noggin (human)	Peprotech	120-10C
P1000, P200, P10 pipettes with tips
p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190	Millipore Sigma	S7067
Parafilm			transparent film
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140122
Plasmid1: pRL-SV40P	Addgene	27163
Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash	Addgene	12457
Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash	Addgene	12456
pluriStrainer 200 µm	pluriSelect	43-50200-01
Primocin	Invivogen	ANT-PM-1
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Thermo Fisher (Gibco)	12648-010	cell freezing medium
Red Blood Cell lysis buffer	Millipore Sigma	11814389001
R-spondin conditioned media	In-house or commercial from Peprotech	120-38
Scalpel (No.10)	Sklar Instruments	Jun-10
Shaker (Incu-shaker Mini)	Benchmark	H1001-M
TGF-β receptor inhibitor A 83-01	Tocris	2939
Trypan Blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-061
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red	Life Technologies	12605028	cell dissociation reagent
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent	Millipore Sigma	6365779001
Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi)	Abmole Bioscience	Y-27632
Zeocin	Thermo Fisher	R25001