流式细胞仪之间实验室转移的标准化，用于检测接种日本脑炎疫苗的儿童淋巴细胞

摘要

在这项研究中，开发了一种方法来促进两个实验室中两个流式细胞仪之间实验设置和分析模板的转移，以检测接种日本脑炎疫苗的儿童的淋巴细胞。流式细胞仪实验的标准化方法将使研究项目能够在多个中心有效进行。

摘要

越来越多的实验室需要从多个流式细胞仪收集数据，特别是对于跨多个中心进行的研究项目。在不同实验室使用两台流式细胞仪的挑战包括缺乏标准化材料、软件兼容性问题、仪器设置不一致以及不同流式细胞仪使用不同的配置。为了建立标准化的流式细胞术实验，实现实验结果在多个中心的一致性和可比性，建立了一种快速可行的标准化方法，在不同流式细胞仪之间传递参数。

本研究中开发的方法允许在不同实验室的两个流式细胞仪之间转移实验设置和分析模板，以检测接种乙型脑炎（JE）的儿童的淋巴细胞。使用荧光标准微球在两个细胞仪之间获得一致的荧光强度，以建立细胞仪设置。在两个使用不同类型仪器的实验室中获得了可比的结果。利用该方法，我们可以对不同实验室使用不同仪器评估JE接种儿童免疫功能的分析进行标准化，减少多个中心流式细胞仪之间数据和结果的差异，为实验室结果的相互认证提供可行的方法。流式细胞仪实验的标准化方法将确保跨多个中心的研究项目的有效性能。

引言

流式细胞术的标准化有助于不同实验室和研究中心不同细胞仪结果的可比性，有利于结果的相互认可，提高工作效率。越来越多的方案需要标准化。在药物开发过程中，流式细胞术标准化非常重要，因为开发和验证的检测方法将支持从临床前到临床分析的整个药物开发过程。流式细胞术方法经常在制药行业和合作实验室之间转移¹.此外，从多中心临床研究中获取可比数据至关重要。例如，在系统性自身免疫性疾病多中心临床研究项目中开发了一个标准化工作流程，以获得多中心流式细胞术²的可比数据。

流式细胞术方法的标准化具有挑战性。实验室面临的挑战归因于缺乏标准化材料、软件兼容性问题、仪器设置不一致以及不同流式细胞仪之间使用不同的配置以及中心之间的不同门控策略^3，4。因此，在实验室之间进行差距分析很重要。必须审查样品访问、质量体系、人员资格和仪器配置，以确保满足要求。

目前，接种乙型脑炎（JE）疫苗的儿童乙型乙型肝炎5发病率显著^降低。监测外周血免疫细胞有助于了解接种后细胞介导的适应性免疫的变化，以及外周血淋巴细胞亚群的变化与疫苗接种效果之间的相关性。由于全血样本的稳定性有限，疫苗功效的评估通常在多个中心进行。对于此分析，我们将幼稚CD8+或CD4 + T细胞定义为CD27 + CD45RA+，将中枢记忆T细胞（T_CM）定义为CD27 ⁺ CD45RA-，效应记忆T细胞（T_EM）定义为CD27-CD45RA-，终末分化的效应记忆T细胞（T _EMRA）定义为CD27-CD45RA+。CD19⁺ B细胞可以分为表达CD27与IgD 6，⁷的群体，表达CD27n记忆的幼稚B细胞可以根据^{IgD 6}的表达进行鉴定^，调节性T细胞（Tregs）可以鉴定为CD4 ⁺ CD25⁺⁺ CD127低⁸。为了建立标准化的流式细胞术实验，以实现多个中心实验结果的一致性和可比性，建立了一种快速可行的标准化方法，以促进不同流式细胞仪之间转移方案，以检测接种乙脑疫苗的儿童全血淋巴细胞。从首都医科大学附属北京儿童医院招募了6名健康儿童（2岁）。在不到6个月前接种了JE SA14-14-2减毒活疫苗后，从志愿者身上收集了外周血样本。按照标准化程序从不同仪器获得高度可比的数据，这有助于多中心评估。

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研究方案

该研究已获得首都医科大学北京儿童医院伦理委员会批准（批准文号:2020-k-85）。本研究放弃了人类受试者的知情同意，因为仅使用临床试验后的残留样本。两个实验室参与了这项研究。 转移实验室 是使用一台流式细胞仪开发标准化方法的地方。本实验室的细胞仪以下简称 细胞仪A。测试方法实验室是使用另一个流式细胞仪接收方法的实验室，该 实验室 中的细胞仪在下文中称为 细胞仪B。

1. 外周血样本采集和细胞制备

1. 通过标准静脉穿刺在 EDTA-K 2 抗凝管中收集接种 JE 疫苗的儿童和未接种疫苗的儿童的外周血样本 （₂ mL）。
2. 通过将试管倒置 10 倍来混合全血样品。将 100 μL 全血加入 12 mm x 75 mm 试管中。将每个样本一式两份。
3. 将 10 μL 亮色染色缓冲液（BV 缓冲液）加入 12 mm x 75 mm 试管中。向BV缓冲液中加入5 μL每种抗体（CD45，CD3，CD4，CD8，CD127，CD27，CD19，IgD;稀释因子:1:20）和20 μL抗体（CD25，CD45RA;稀释因子:1:5）。轻轻涡旋。
   注意:抗体试剂的体积和信息如 表1所示。
4. 将抗体混合物与全血样本一起添加到试管中。轻轻涡旋并在室温下在黑暗中孵育15分钟。
5. 用蒸馏水以1:10稀释10x裂解液，制备1x裂解液。通过加入 2 mL 的 1x 裂解溶液来裂解血液样品。轻轻涡旋并在室温下在黑暗中孵育10分钟。
6. 以300× g 离心5分钟，倒出上清液。
7. 将沉淀重悬于2mL的1x PBS中，以300× g 离心5分钟，然后倒出上清液。
8. 将沉淀重悬于 0.5 mL 的 1x PBS 中并充分混合。储存在2°C至8°C。 将样品送到两个实验室进行流式细胞术分析。
   注意:阴性对照样品和细胞单染色对照必须同时处理。

2. 制备补偿珠和单染色对照

1. 标记 V500-抗 CD45 单染色、APC-H7-抗 CD3 单染色、FITC-抗 CD4 单染色、R718-抗 CD8 单染色、BV605-抗 CD27 单染色、APC-抗 CD45RA 单染色、PE-抗 CD25 单染色、BV421-抗 CD127 单染色、BB700-抗 CD19 单染色和 PE-CY7-抗 IgD 单染色管。
2. 将 100 μL 含有 1% 胎牛血清 （FBS） 的 1x Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 缓冲液加入 5 mL 圆底聚苯乙烯试管中。
3. 向每个试管和涡旋中加入 50 μL 负磁珠和 50 μL 抗小鼠 Ig、κ 磁珠。
4. 向单染色管中加入 2 μL 每种标记抗体（CD45、CD3、CD4、CD8、CD25、CD127、CD45RA、CD27、CD19、IgD）。轻轻涡旋混合物，并在室温（20°C至25°C）下在黑暗中孵育15分钟。
5. 将珠子重悬于2 mL 1x PBS中，以300 × g 离心5分钟，然后倒出上清液。
6. 将磁珠重悬于 0.5 mL 的 1x PBS 中并充分混合。储存在2°C至8°C。

3. 在两个实验室的不同细胞仪上使用相同的配置名称

1. 在流式细胞仪 A 的软件中创建新配置，单击 "流式细胞仪 "按钮并选择 "查看 配置"以显示配置窗口。
2. 在配置列表中，右键单击 基本配置文件夹，选择 新建文件夹，然后重命名。
3. 右键单击 基本配置 ，然后选择 复制。
4. 右键单击 新文件夹 并粘贴基本配置以创建新配置。将新配置重命名为"标准化方法传输"。
5. 将参数 名称（如 FITC）从 "参数"列表 拖到 相应的检测器 （530/30） 上。
6. 将其他参数（PE、BB700、PE-CY7、APC、R718、APC-H7、BV421、V500 和 BV605）编辑到新配置。
7. 按照此方法在具有相同名称"标准化方法转移"的不同流式细胞仪型号上创建新配置。确保配置包含每个检测器的相同参数。
   注意:要成功识别两种不同流式细胞仪型号的实验模板，请确保名称一致。
8. 在细胞仪 配置下，使用 细胞仪设置和跟踪 （CST） 微球定义细胞仪基线并跟踪细胞仪性能。单击 "细胞仪 "按钮并选择 CST 以显示流式细胞仪设置和跟踪工作区。
9. 在 5 mL 圆底聚苯乙烯试管中，将三滴 （150 μL） 设置珠加入 0.5 mL 的 1x PBS 中。将磁珠管放在细胞仪上。
10. 在" 设置控制 "窗口中，选择" 定义基线"，然后单击" 运行"。

4. 在转移实验室中使用细胞仪A进行标准化实验

1. 使用细胞仪设置和跟踪微球运行性能检查，以验证细胞仪是否运行良好。
2. 在软件浏览器窗口中，右键单击细胞仪设置，然后选择应用程序设置以创建工作表。
3. 使用未染色的样品，调整FSC，SSC的光电倍增管（PMT）电压和所有荧光参数。FSC: 260;SSC: 460;FITC: 490;PE: 575;BB700: 620;PE-CY7: 640;APC: 600;R718: 620;APC-H7: 620;BV421: 466;V500: 420;和 BV605:505。
4. 右键单击实验细胞仪设置，然后选择应用程序设置以保存它。
5. 单击 实验 按钮并选择 补偿设置 菜单。然后，选择 创建薪酬控制以 自动添加薪酬控制。
6. 记录所有补偿控制磁珠的数据。
7. 单击 实验 并选择 补偿设置。然后，自动计算补偿。
8. 记录细胞单染色对照的数据。
9. 使用CD45RA APC将R718的补偿值修改为15%APC。使用CD19 BB700将APC-H7的补偿值修改为14%BB700。使用CD8 R718将APC-H7的补偿值修改为60%R718。
10. 记录CST磁珠的数据。
11. 为 CST 亮珠创建目标值模板的全局工作表。
12. 使用 FSC/SSC 图，绘制 CST 亮珠的多边形门。获得CST亮珠的10个荧光通道的直方图:FITC，PE，BB700，PE-Cy7，APC，R718，APC-H7，BV421，V500和BV605。在直方图中创建区间门。通过显示间隔门的中位数来创建统计视图。
13. 在流式细胞仪上运行样品;总共收集25，000个淋巴细胞。
14. 为样本创建分析模板的全局工作表。
15. 使用以下示例门控策略:
    1. 使用 CD45/侧散射面积 （SSC-A） 点图绘制多边形门以识别完整的淋巴细胞群，同时排除碎片。
    2. 使用 CD3/CD19 点图，绘制一个矩形门以选择 CD3+ T 细胞和 CD19⁺ B 细胞。
    3. 使用 CD4/CD8 点图，绘制四门以选择 CD4+ 或 CD8⁺ T 细胞（分别具有这些标记物高荧光的细胞）。
    4. 使用 CD45RA/CD27 点图，绘制一个四门将 CD8+ 或 CD4+ T 细胞细分为幼稚细胞 （CD27⁺CD45RA+）、T_CM （CD27+ CD45RA-）、T_EM （CD27-CD45RA-） 和 T_EMRA （CD27-CD45RA+） 细胞。
    5. 使用 CD25/CD127 点图，绘制一个四门，将 CD4⁺ T 细胞细分为 Treg 细胞（CD4⁺CD25⁺⁺CD127^低）。
    6. 使用 CD27/IgD 点图，绘制一个四门，将 CD19+ B 细胞细分为幼稚 B 细胞 （CD27-IgD⁺） 和记忆 B 细胞 （CD27⁺IgD^-）。
16. 将实验模板保存在 细胞仪A上。
17. 使用 CD-ROM 导出实验模板。

5.将实验模板转移到测试方法实验室的细胞仪B

注意:实验模板包括仪器设置、分析模板和中位荧光强度 （MFI） 的目标值模板。

1. 使用 CST 微球进行性能检查，以验证细胞仪是否表现良好。
2. 导入实验模板并使用该模板为细胞仪 B 创建实验。
3. 使用相同批次的CST磁珠调整每个荧光通道的荧光参数电压，以匹配以前的MFI仪器。
   注意:MFI值在±5%以内变化（转印前后光珠的MFI如 表2所示）。
4. 如果需要，使用未染色的样品调整FSC的电压。
5. 右键单击 实验细胞仪 设置，然后选择应用程序设置以保存 应用程序设置 。
6. 使用CD45RA APC将R718的补偿值修改为15%APC。使用CD19 BB700将APC-H7的补偿值修改为24%BB700。使用CD8 R718将APC-H7的补偿值修改为60%R718。
7. 在流式细胞仪上运行样品;总共收集25，000个淋巴细胞。

6.在两个细胞仪上获得的实验结果之间的一致性

1. 使用单因素方差分析评估仪器之间淋巴细胞亚群的差异（p < 0.05）。

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结果

图1显示了CST亮珠的目标值模板的全局工作表。使用 FSC/SSC 图绘制多边形门以选择 CST 亮珠。获得CST亮珠的10个荧光通道的直方图:FITC，PE，BB700，PE-Cy7，APC，R718，APC-H7，BV421，V500和BV605。通过显示 表2中直方图门内的中位数来显示每个参数的目标值。细胞仪A和细胞仪B软件中的模板和参数设置截图见 补充图S1。

图 2 显示了仪器标准?...

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讨论

外周血淋巴细胞亚群的免疫分型有助于了解儿童接种疫苗后细胞介导的适应性免疫的变化。在临床应用中，会出现意外情况，如未能及时检测样本或更换流式细胞仪;因此，需要快速标准化的方法，以促进不同实验室中流式细胞仪之间的转移⁹，^10，11。在这里，我们描述了一种快速标准化的方法，以确保不同仪器之间的结果一致...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843	compensation
BD FACSCanto	BD	FACSCanto	flow Cytometry A in the transferring lab
BD FACSDiva CS&T Research Beads	BD	655051	define flow cytometer baseline and track cytometer performance
BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127	BD	562436	Fluorescent antibody
BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27	BD	562656	Fluorescent antibody
BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45	BD	560777	Fluorescent antibody
BD LSRFortessa	BD	LSRFortessa	flow Cytometry B in the test method lab
BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19	BD	745907	Fluorescent antibody
BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8	BD	751953	Fluorescent antibody
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA	BD	550855	Fluorescent antibody
BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3	BD	560176	Fluorescent antibody
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4	BD	566320	Fluorescent antibody
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25	BD	555432	Fluorescent antibody
BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD	BD	561314	Fluorescent antibody
Brilliant Staining Buffer Plus	BD	566385	Staining Buffer
Centrifuge	Eppendorf	5810	Cell centrifugation
Centrifuge Tube	BD Falcon	BD-35209715	15 mL centrifuge tube
CS&T IVD Beads	BD	662414	standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer
Lysing Solution 10x Concentrate	BD	349202	lysing red blood cells
Phosphate-buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023	PBS
Round-bottom test tube	BD Falcon	352235	5 mL test tube