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摘要

该协议提供了触发和监测活细胞中Stub1介导的吞噬的说明。

摘要

哺乳动物细胞可以通过Stub1介导的噬菌体翻转过氧化物酶体。该途径可能允许细胞控制过氧化物酶体的数量和质量。在此过程中，热休克蛋白70和泛素E3连接酶Stub1易位到过氧化物酶体上以翻转以启动pexophation。Stub1连接酶活性允许泛素和其他自噬相关模块在靶向过氧化物酶体上的积累。提高过氧化物酶体腔内的活性氧 （ROS） 水平可以激活 Stub1 介导的噬菌。因此，可以使用染料辅助ROS生成来触发和监测该途径。本文概述了使用两类染料（荧光蛋白和合成荧光团）在哺乳动物细胞培养物中启动噬寡糖的程序。这些基于染料辅助ROS生成的方案不仅可以用于靶向全球细胞群中的所有过氧化物酶体，还可以允许操纵单个细胞内的单个过氧化物酶体。我们还描述了如何使用活细胞显微镜跟踪Stub1介导的噬寡噬。

引言

过氧化物酶体是存在于大多数真核细胞中的单膜结合细胞器。过氧化物酶体是进行超长链脂肪酸的β-氧化、嘌呤分解代谢以及醚磷脂和胆汁酸合成所必需的代谢区室1。过氧化物酶体衍生的乙酰辅酶A通过调节代谢中的中枢信号传导来控制脂质稳态2。因此，过氧化物酶体功能受损隐含在各种疾病中也就不足为奇了，包括神经退行性疾病、衰老、癌症、肥胖和糖尿病3，4，5。维持过氧化物酶体操作的一个基本过程是噬菌。噬菌是一种分解代谢过程，用于通过自噬选择性周转过氧化物酶体。细胞使用pexophagy来帮助控制过氧化物酶体的数量和质量，从而确保适当的过氧化物酶体功能。最近的一项研究表明，由PEX1过氧化物酶体生物发生因子1和6突变引起的过氧化物酶体丢失是由不受控制的pexophagy6引起的。值得注意的是，65% 的过氧化物酶体生物发生障碍 （PBD） 患者存在过氧化物酶体 AAA ATP 酶复合物缺陷，该复合物由哺乳动物细胞中的 PEX1、PEX6 和 PEX26 组成7。

许多方法可用于启动和研究噬菌。在酵母中，当提供的营养物质从过氧化物酶体依赖性碳源切换到过氧化物酶体依赖性碳源（以降低细胞过氧化物酶体数量）时，就会触发噬菌8。例如，甲醇生长的毕赤酵母细胞从甲醇培养基转移到葡萄糖培养基和乙醇培养基分别诱导微噬和巨噬8，9，10。微食螯合通过重塑液泡形成杯状液泡封存膜和称为微食特异性膜装置（MIPA）的盖状结构来聚集过氧化物酶体以进行降解。在巨噬中，单个过氧化物酶体被称为噬小体的双膜结构吞噬，然后与液泡融合以进行降解8，9，10。噬菌受体的磷酸化，例如酿酒酵母中的Atg36p和毕赤酵母中的Atg30p，对于受体募集核心自噬机制和促进过氧化物酶体靶向自噬体8，11至关重要。

在哺乳动物细胞中，泛素化可诱导食脂。在胞质侧用泛素标记过氧化物酶体膜蛋白PMP34或PEX3诱导噬寡糖12。PEX3的过表达诱导过氧化物酶体泛素化和溶酶体消除过氧化物酶体13。此外，PEX5与C末端EGFP的融合会损害单泛素化PEX5的输出并导致噬菌14。另一方面，食肉也可以由H2O2 治疗触发。过氧化物酶体产生活性氧（ROS）;具体来说，催化超长链脂肪酸（>22碳）β-氧化初始步骤的过氧化物酶体酶Acox1不仅产生乙酰辅酶A，还产生过氧化物酶体ROS。为了响应H2O2 处理下ROS水平升高，哺乳动物细胞激活噬菌以降低ROS产生并缓解压力。据报道，H2O2 治疗驱动共济失调-毛细血管扩张突变 （ATM） 募集到过氧化物酶体。然后ATM磷酸化PEX5，通过噬菌15促进过氧化物酶体周转。

由于过氧化物酶体是产生ROS的中心，因此它们也容易受到ROS损伤。ROS引发的过氧化物酶体损伤迫使细胞激活食磷脂，以启动过氧化物酶体质量控制途径（通过自噬去除受损的过氧化物酶体）。在这里，我们概述了一种按需触发ROS诱发的过氧化物酶体损伤的方法。该协议利用细胞器16，17，18，19，20内的光激活ROS产生（图1）。染料标记的过氧化物酶体被照亮，导致过氧化物酶体腔内产生ROS，从而特异性触发过氧化物酶体损伤。使用该协议，显示ROS应激过氧化物酶体通过泛素依赖性降解途径去除。ROS应激的过氧化物酶体招募泛素E3连接酶Stub1，以允许它们吞噬到自噬体中，以便通过噬菌16进行个体去除。可以使用该协议通过延时显微镜比较同一细胞内受伤和健康过氧化物酶体的命运。该方法还可用于全局破坏培养皿上的所有过氧化物酶体（在所有细胞中），从而允许对噬菌途径进行生化分析。

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研究方案

1. 制备在过氧化物酶体腔中表达diKillerRed或自标记蛋白（SLP）的细胞

  1. 将所需细胞接种在玻璃底细胞培养皿上。对于此处的实验，在 840 μL 培养基（补充有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素的 DMEM/F-12）中接种 2 x 105 人 SHSY5Y 细胞，或在 840 μL 培养基（补充有 10% 牛血清和 1% 青霉素/链霉素的 DMEM）中接种 2 x 105 个人 SHSY5Y 细胞，在直径为 20 mm 的玻璃微孔的 35 mm 培养皿上接种 6 x 10 4 小鼠 NIH3T3 细胞。
    注意:使用其他规格的玻璃底培养皿时，应根据玻璃微孔面积按比例调整接种的细胞数。
  2. 将细胞在5%CO2 / 37°C下生长24小时。
  3. 使用转染试剂用所需质粒转染细胞。
    1. 使用PMP34-TagBFP标记活细胞中的过氧化物酶体。使用过氧化物酶体靶向diKillerRed-VKSKL或SLP-VKSKL（+染料标记的SLP配体）在过氧化物酶体腔中产生ROS（通过光激活ROS产生）。在该协议中，我们使用自标记蛋白HaloTag-VKSKL21。为了监测Stub1 / Hsp70的易位，泛素化蛋白的积累以及ROS应激过氧化物酶体上自噬体的形成，分别转染EGFP-Stub1，EGFP-Hsp70，EGFP-Ub或EGFP-LC3B。为了检查过氧化物酶体腔中的ROS生成，将diKillerRed-VKSKL与过氧化物酶体定位的荧光氧化还原探针roGFP2-VKSKL22共转染。
    2. 对于 SHSY5Y 细胞转染，将质粒稀释在 55 μL 无血清 DMEM/F-12 中，在 55 μL 无血清 DMEM/F12 中稀释 1 μL 转染试剂。将稀释的DNA与稀释的试剂相结合。轻轻混合，并在室温下孵育30分钟。
    3. 将复合物添加到先前接种有 100 μL 培养基的 20 mm 微孔中，用于不含抗生素的 SHSY5Y（DMEM/F-12 含 10% 胎牛血清）。轻轻地来回摇晃盘子。
    4. 对于NIH3T3细胞转染，用还原血清培养基代替无血清DMEM / F-12，以稀释质粒和转染试剂。用不含抗生素的NIH3T3细胞培养基（含10%牛血清的DMEM）用SHSY5Y替换电镀培养基。
  4. 转染2小时后，除去含转染试剂的培养基，加入1mL新鲜培养基。将NIH3T3或SHSY5Y细胞在37°C和5%CO2 下孵育24小时。
    注意:其他细胞系也可用于研究Stub1介导的噬菌（例如，HeLa细胞）。

2. 用染料标记的 SLP 配体染色过氧化物酶体（用于光活化 ROS 生产）

  1. 在转染后24小时，除去培养基，并将100μL的200nM HaloTag TMR配体或200nM Janelia Fluor 646 HaloTag配体加入20mm玻璃微孔中。
    注意:染料标记的SLP配体应用每个细胞系的相应培养基稀释。选择珍妮莉亚福陆646标记的配体将释放蓝色、绿色和红色通道，用于下游荧光成像。
  2. 将培养皿转移到 37°C、5% CO2 培养箱中。染色1小时。1小时后，彻底除去染色培养基，并加入1mL新鲜培养基。

3. 过氧化物酶体在激光扫描共聚焦显微镜上的ROS应激

  1. 将含有所需细胞的玻璃底培养皿放在配备有载物台顶部培养箱的激光扫描共聚焦显微镜上。
  2. 单击 工具窗口，选择 目镜，然后单击 DIA 按钮（图2A）以打开透射光。通过显微镜目镜观察培养皿，并通过转动聚焦旋钮使细胞聚焦。
  3. 选择LSM，然后单击染料和检测器选择按钮（图2B）。在弹出窗口中双击所需的染料，以选择适当的激光和滤光片设置来对细胞进行成像（图2C）。单击Live面板中的Livex4以启动快速激光扫描，以开始筛选细胞的荧光信号（图2D）。
  4. 使用操纵杆控制器移动载物台，并找到表达diKillerRed-VKSKL或SLP-VKSKL的培养基细胞以施加ROS应激（在过氧化物酶体上）。获取所需细胞的图像。
  5. 单击 工具窗口，然后选择 LSM刺激 （图2E）。单击 椭圆 按钮，在实时图像窗口中，使用鼠标绘制直径为15μm的圆形ROI（图2F），其中包含在步骤3.4中获得的所需过氧化物酶体，将对其施加ROS应力（有关示例，请参见 图3 ）。
  6. 要施加 ROS 应力，对具有 diKillerRed-PTS1- 或 TMR 标记的 SLP 配体的细胞使用 561 nm，对用 Janelia Fluor 646 标记的 SLP 配体染色的细胞使用 640 nm。
  7. 选择用于施加 ROS 应力的激光波长。输入所需的激光百分比和持续时间（图2G）。
  8. 单击" 获取"，然后单击 "刺激 "按钮（图2H）以启动以561/640 nm光通过ROI进行扫描，每个扫描30秒。这相当于此处使用的共聚焦显微镜上561 nm和640 nm的~5%激光功率设置。此操作将导致过氧化物酶体中产生ROS。
    注意:可以选择不同大小的投资回报率。应根据每个ROI的面积按比例调整其照明时间。
  9. 激光照射30秒后，ROI内的过氧化物酶体将失去其diKillerRed-PTS1 / TMR / Janelia Fluor 646信号。这种信号损失使人们能够区分细胞内的发光和非发光过氧化物酶体（受损与健康）。

4. 通过延时成像监测活细胞中的噬菌

  1. 通过延时成像，使用帧之间的 10 分钟间隔进行延时成像，跟踪 EGFP 标记的 Stub1、Hsp70、Ub、p62 或 LC3B 在发光/ROS 应激过氧化物酶体上的易位（例如，参见 图 3-7）。
    注意:EGFP-Stub1 或 EGFP-Hsp70 信号在照明后 10-20 分钟开始出现，并停留在所有受损的过氧化物酶体上，直到照明后 ~40 分钟。EGFP-Ub信号在照明后30分钟出现，持续2-3小时.EGFP-p62易位在照明后60分钟出现，EGFP-LC3B信号在照明后~3小时可见。
  2. 使用 ImageJ 量化受损过氧化物酶体（来自 Stub1、Ub、p62 或 LC3B）上的 EGFP 信号。执行以下步骤，使用 ImageJ 量化三通道图像（PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL）。
    1. 打开图像，应用 椭圆 选择或 手绘选择 以包围包含所有发光过氧化物酶体的区域（PMP34-TagBFP 信号阳性和 HaloTag 配体信号漂白; 图8A）。
    2. 单击 "复制 "以挑选PMP34-TagBFP通道（图8A）。使用下拉菜单图像 >调整阈值 设置阈值>以标记过氧化物酶体（图8B）。
    3. 选择 "分析">"分析粒子 "以确定发光过氧化物酶体的确切区域。ImageJ 在 ROI 管理器中记录这些感兴趣区域 （ROI）（图 8C）。
    4. 单击 "复制 "以选择用于分析来自EGFP偶联Ub，p62或LC3B的荧光信号的EGFP通道（图8D）。在ROI管理器中选择所有ROI（图8E）。
    5. 在ROI管理器中应用测量以 测量 过氧化物酶体上的EGFP信号（图8E）。在结果表中查找每个ROI的面积和积分密度（所有像素强度的总和）的值（图8E）。
    6. 为了获得照明后不同时间点的平均EGFP荧光强度，将积分EGFP强度除以发光过氧化物酶体的总面积（PMP34-TagBFP信号阳性和HaloTag配体信号负区域）。要获得过氧化物酶体上的累积信号，请将时间点的平均强度减去时间 = 0 处的平均强度，然后按时间 = 0 处的平均强度归一化。

5. 全局破坏培养皿上的所有过氧化物酶体（每个细胞中）

  1. 执行步骤1（制备表达过氧化物酶体靶向diKillerRed [diKillerRed-VKSKL]或SLP [SLP-VKSKL]的细胞）和步骤2（用SLP配体染色过氧化物酶体[用于光活化ROS生产]）。
  2. TMR标记的配体染色1小时后，除去染色培养基，并加入1mL含有30mM 3-AT（3-氨基-1，2，4-三氮唑;过氧化氢酶抑制剂）的培养基。
    注意:过氧化氢酶是在过氧化物酶体管腔中表达的ROS清除剂，因此3-AT处理有助于增加过氧化物酶体上光诱发的氧化损伤。
  3. 将培养皿放在 LED （555-570 nm） 上方。在培养箱中以1.8W / cm2 的功率密度照亮所有细胞9小时。
    注意:要在培养箱外执行此步骤，请将培养皿放在37°C加热板上。将 20 mM HEPES 添加到含 3-AT 的培养基中，并用透明薄膜覆盖培养皿以尽量减少气体交换。HEPES 是一种缓冲剂，可在 LED 照明期间在 CO2 培养箱外的细胞培养物中维持生理 pH 值。
  4. 通过对过氧化物酶体上的 EGFP-Ub、EGFP-p62 或 EGFP-LC3B 信号进行成像，验证 LED 诱发损伤的成功与否。使用上述光照条件，82%稳定表达HaloTag-VKSKL的SHSY5Y细胞显示出Stub1介导的吞噬。
  5. 收获细胞进行下游生化分析。

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结果

此处显示的Stub1介导的噬菌诱导方案利用了过氧化物酶体腔内的染料辅助ROS生成。此操作需要最小的光强度。因此，含有荧光蛋白或染料的过氧化物酶体可以使用标准激光扫描共聚焦显微镜照射。聚焦照明导致单个过氧化物酶体内瞬时和局部ROS产生，如荧光报告基因roGFP2-VKSKL所示（图9）。我们没有在roGFP2-VKSKL测量中对diKillerRed-VKSKL进行成像，以避免在成像过程中产生额外的RO...

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讨论

该协议详细介绍了如何通过用光提高过氧化物酶体ROS水平来触发细胞培养物中Stub1介导的噬菌。由于该方案依赖于染料辅助ROS生成，因此需要确保在目标细胞内充分表达diKillerRed-VKSKL或染料标记的SLP配体染色。鉴于不同的细胞类型或不同遗传背景的细胞可能含有性质略有不同的过氧化物酶体，可能需要调整确切的照明条件以确保诱导pexophagy。筛查Stub1介导的噬细胞活化的一种可靠措施是监测EGFP-Ub是...

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披露声明

作者声明没有相互竞争的经济利益。

致谢

这项工作部分得到了台湾国家科学技术委员会的MOST 111-2311-B-001-019-MY3研究资助。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell MatTekP35G-1.5-20-C20 mm glass bottomed
3-amino-1,2,4-triazole (3-AT)Sigma AldrichA8056
bovine serumThermoFisher Scientific16170060
Cell culture incubatorNuaireNU-4750
diKillerRed-PTS1Academia Sinicamade by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL)
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)ThermoFisher Scientific11965092
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12)ThermoFisher Scientific11330032
EGFP-C1ClontechpEGFP-C1The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62
EGFP-Hsp70Academia SinicaHsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1
EGFP-LC3BAddgene11546
EGFP-p62Academia Sinicagenerated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1
EGFP-Stub1Academia Sinicagenerated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1
EGFP-UbAddgene11928
fetal bovine serumThermoFisher Scientific10437028
HaloTag TMR ligand PromegaG8252
HaloTag-PTS1Academia SinicaPTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone
HEPESThermoFisher Scientific15630080
Inverted Confocal Microscope OlympusFV3000RS405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,  microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment
Janelia Fluor 646 HaloTag LigandPromegaGA1120
LEDVitaStarPAR6480 W, 555-570 nm
lipofectamine 2000 ThermoFisher Scientific11668transfection reagent
NIH3T3 cellATCCCRL-1658adherent
Opti-MEMThermoFisher Scientific319850reduced serum media
penicillin/streptomycinThermoFisher Scientific15140
PMP34-TagBFPAcademia SinicaPMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171)
roGFP2-PTS1Academia Sinicagenerated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1
SHSY5Y cellATCCCRL-2266adherent

参考文献

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