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摘要

本研究开发了一种非侵入性和实时方法，基于[68Ga] D-十二肽拮抗剂的正电子发射断层成像，评估程序性死亡配体1在全身的分布。与传统的免疫组化相比，该技术具有优势，并提高了识别将从免疫检查点阻断疗法中受益的合适患者的效率。

摘要

近年来，基于程序性细胞死亡蛋白 1 （PD-1）/程序性死亡配体 1 （PD-L1） 的免疫检查点阻断疗法的发展彻底改变了癌症治疗。然而，由于 PD-L1 在肿瘤细胞中的异质表达，只有一小部分患者对 PD-1/PD-L1 抑制剂有反应。这种异质性给常用的免疫组化（IHC）方法精确检测肿瘤细胞带来了挑战。这种情况需要更好的方法来对将从免疫检查点阻断疗法中受益的患者进行分层，以提高治疗效果。正电子发射断层扫描 （PET） 能够以非侵入性方式实时可视化全身 PD-L1 表达。因此，需要开发放射性标记的示踪剂，通过PET成像检测PD-L1在肿瘤中的分布。

与L-肽相比，右旋（D）肽具有蛋白水解抗性和显著延长的代谢半衰期等特性。本研究设计了一种基于 68个Ga标记的PD-L1靶向D肽（一种D-十二肽拮抗剂（DPA））的PET成像检测PD-L1表达的新方法。结果表明，[68Ga]DPA 在体内可特异性结合PD-L1过表达的肿瘤，并显示出良好的稳定性和优异的成像能力，表明[68Ga]DPA-PET是评估肿瘤中PD-L1状态的一种有前途的方法。

引言

免疫检查点蛋白的发现是肿瘤治疗的突破，并导致了免疫检查点阻断疗法发展的重大进展1。程序性细胞死亡蛋白 1 （PD-1） 和程序性死亡配体 1 （PD-L1） 是美国食品和药物管理局 （FDA） 批准的多种抗体的潜在药物靶点。PD-1 由肿瘤浸润免疫细胞表达，例如 CD4+、CD8+ T 细胞和调节性 T 细胞。PD-L1 是 PD-1 配体之一，在多种肿瘤细胞中过表达 2,3。PD-1 和 PD-L1 之间的相互作用使 PD-1 失活，从而抑制抗肿瘤免疫反应4。这些发现表明，抑制PD-L1可以提高免疫细胞的杀伤效果并消除肿瘤细胞5。目前，显色免疫组化 （IHC） 是识别最有可能对免疫检查点治疗有反应的患者的最常用方法 6,7。然而，由于 PD-L1 在肿瘤细胞中的异质表达，活检的 IHC 结果无法提供有关患者 PD-L1 表达的准确信息8。先前的研究报告称，只有 20%-40% 的患者从免疫检查点阻断疗法中获得长期益处 1,9,10。因此，迫切需要开发一种新方法来规避这些免疫检查点蛋白的异质性表达引起的假阴性结果。

分子成像技术，如正电子发射断层扫描（PET），能够以非侵入性方式实时观察整个身体，因此可以优于传统的IHC方法11,12,13。放射性标记的抗体、肽和小分子是监测癌症患者 PD-L1 表达的有前途的示踪剂 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25.FDA 已批准三种 PD-L1 治疗性单克隆抗体:avelumab、atezolizumab 和 durvalumab26。基于这些抗体的免疫PET示踪剂已被充分记录在案27,28,29,30,31,32。早期临床试验显示，由于不利的药代动力学30，临床应用的价值有限。与抗体相比，肽在血液和器官中清除健康器官的速度更快，并且可以很容易地进行化学修饰33。已报道了对 PD-1/PD-L1 具有高亲和力的多种肽2;WL12 是一种已报道的肽，显示出与 PD-L134 的特异性结合。据报道，放射性标记的示踪剂 [64Cu]WL12、[68Ga]WL12 和 [18F]FPyWL12 显示出高体内特异性肿瘤靶向能力，从而可以收获肿瘤中 PD-L1 表达的高质量图像 26,35,36,37。此外，对放射性标记的 WL12 的首次人体评估表明，[68Ga]WL12（由 NOTA 螯合）在临床肿瘤成像方面具有安全有效的潜力38。由于其高疏水性和在健康肝脏中的高摄取性，WL12的临床应用有限。其他与 PD-L1 特异性结合的放射性标记肽，如 TPP1 和 SETSKSF，也显示出潜在的稳定性和特异性，可可视化全身 PD-L1表达 39,40。然而，未修饰的肽很容易被蛋白酶降解，并被肾脏迅速代谢。由于左旋（L）肽的稳定性较差，右旋（D）肽已被广泛用作有效的介质41,42,43。D-肽对蛋白水解降解具有超强的抵抗力，并且具有显着延长的代谢半衰期。与L-对应物相比，D-肽大多表现出特异性结合能力44,45,46。

本研究设计了一种检测 PD-L1 表达的新方法，基于 68Ga 标记的 PD-L1 靶向 D 肽、D-十二肽拮抗剂 （DPA） 的 PET 成像，在荷瘤小鼠模型 47 中。首先在磷酸盐缓冲盐水（PBS）和小鼠血清中研究了[68Ga]DPA的稳定性，然后测试了[68Ga]DPA在PD-L1过表达肿瘤中的结合亲和力。此后，在胶质母细胞瘤异种移植模型中进行 PET 成像，以确认 [68Ga]DPA 是否是监测肿瘤中 PD-L1 表达的理想 PET 示踪剂。PET成像和DPA的结合不仅为克服PD-L1异质表达相关的挑战提供了一种新方法，而且还为开发基于D肽的放射性示踪剂奠定了基础。

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研究方案

动物实验程序经南京医科大学动物伦理委员会或美国量子科学技术研究院批准。小鼠实验严格按照实验动物护理和使用委员会的机构准则进行。

1. 多肽合成

  1. 在温和的N2鼓泡下，将100mg 4-甲基苯甲胺（MBHA）树脂（负载量为0.37 mmol/g）在1 mL N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）中溶胀30分钟。
  2. 在 1 mL NMP 中制备由 Fmoc 保护氨基酸（5.0 当量）、HCTU（4.9 当量）和 DIPEA（10.0 当量）组成的新鲜储备缓冲液，然后加入树脂 （100 mg）。让偶联反应进行1.5-2小时。
  3. 在NMP中制备由50%（体积/体积）吗啉组成的脱保护缓冲液。在每次洗涤中用1mL脱保护缓冲液洗涤树脂（100mg）2×30分钟，以除去胺基上的Fmoc基团。用二氯甲烷（DCM;1 mL）洗涤树脂1分钟，去除DCM，再用NMP（1 mL）重新洗涤树脂1分钟。接下来，取出NMP并用DCM重新洗涤树脂1分钟。
    注意: 所有洗涤程序均在温和的 N2 起泡下进行。重复上述过程，直到最后一个氨基酸。
  4. 为了向肽中加入1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（DOTA），用 N-（3-二甲氨基丙基）-N-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）和 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）。孵育DOTA/EDC·HCl/NHS 在二甲基亚砜 （DMSO） 中以 1:1:1 的摩尔比溶液 3 小时，最终 DOTA 浓度为 1 M。接下来，将储备缓冲液（1mL）加入树脂（100mg）中，并让反应以温和的N2 起泡进行2小时。
    注:1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸（NOTA）也可用作 68Ga络合物的螯合剂。相同的程序可用于 NOTA 耦合。
  5. 使用DCM从顶部彻底冲洗树脂，并施加真空以同时除去残留的反应溶液。使用 DCM （1.5 mL） 冲洗树脂 3 次，然后用 MeOH （1.5 mL） 冲洗以收缩树脂。将树脂置于氮气下过夜，或在高真空下至少4小时，直到树脂变干。
  6. 将干燥的含 DPA 肽的树脂放入带螺旋盖的 2 mL 聚丙烯容器中。加入适当的裂解混合物（95/2.5/2.5 TFA/TIS/H2O体积;1 mL/100 mg树脂），并用螺旋盖密封容器。在20-25°C的通风橱中的轨道振荡器上轻轻搅拌反应2小时。
    注意:由于三氟乙酸 （TFA） 具有高度腐蚀性，因此在穿着防护服的通风橱中制备三氟乙酸 （TFA）。
  7. 通过在通风橱中的氮气下蒸发除去大部分反式脂肪酸。通过加入乙醚（~1.5 mL/100 mg树脂）沉淀肽。
  8. 涡旋混合物以研磨肽并在室温（10,000× g，5分钟）下离心。小心地将溶剂从容器中倒出。重复步骤 1.7-1.8。
  9. 将残留物在打开的容器中风干10分钟。加入50%（体积/体积）乙腈水溶液，涡旋1-2秒以溶解产物（1mL/100mg树脂）。
  10. 通过过滤混合物除去树脂，然后使用 0.2 mL 50% （vol/vol） 乙腈水溶液洗涤树脂 2 次。混合滤液进行高效液相色谱（HPLC）纯化。使用以下HPLC条件。色谱柱:YMC-Triat-C18（内径 4.6 mm，150 mm，5 mm）;溶剂梯度:溶剂A-去离子水;溶剂B-乙腈（0.1%TFA）;流动时间:20分钟，用乙腈从10%到90%;流速:1 mL/min。
  11. 将收集的HPLC洗脱液在-80°C下冷冻过夜并冻干（-50°C和<1pa）。对于放射性标记，将固体肽溶解在终浓度为 1 mg/mL 的乙酸钠缓冲液（100 mM，pH 5.0）中作为储备缓冲液。

2. 68Ga放射性标记

注 68Ga是在南京第一医院（中国南京）使用 68Ge/68Ga发生器在内部产生的。

  1. 将 5 μL 储备缓冲液移液到带螺旋盖的 1.5 mL 聚丙烯容器中。向容器中加入 200 MBq [68Ga]GaCl3 （400 μL）。
  2. 涡旋混合物 5 秒。使用pH试纸测量pH值。用NaOH（0.1M）将pH调节至4-4.5。
    注意:适当的pH值对于 68Ga和DOTA之间的络合至关重要。
  3. 将溶液在室温下孵育5-10分钟。在以下条件下，将反应混合物置于放射性HPLC中进行放射性标记产率分析:色谱柱:YMC-Triat-C18（内径4.6mm，150mm，5mm）;溶剂梯度:溶剂A-去离子水;溶剂B-乙腈（0.1%TFA）;流动时间:20分钟，用乙腈从10%到90%;流速:1 mL/min。
    注意:放射性薄层色谱法（TLC）可用作检查放射性标记产率的替代方法。建议的TLC洗脱缓冲液为0.1 M Na3C6H5O7，pH 4。

3.示踪剂稳定性试验

  1. PBS示踪剂稳定性测试
    1. 将 [68Ga]DPA（10 μL，3.7 MBq，NaOAc 溶液）加入 PBS （990 μL） 中。在37°C下孵育1,2和4小时，轻微搅拌。
    2. 在每个时间点收集 200 μL 溶液。将其注入放射性HPLC进行分析。
  2. 小鼠血清中的示踪剂稳定性
    1. 将[68Ga]DPA（10μL，~3.7MBq，NaOAc溶液）加入小鼠血清（90μL，新鲜制备）中。在37°C下孵育1,2和4小时，轻微搅拌。
    2. 在每个时间点收集 20 μL 溶液。加入MeCN和水（100μL，1:1，v/v）。
    3. 将混合物离心10分钟（5,000× g，25°C）。使用放射性HPLC分析上清液。

4. 流式细胞术分析PD-L1表达

  1. 通过向 RPMI-1640 培养基补充 10% （vol/vol） 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素 （vol/vol） 来制备培养基。将U87MG细胞重悬于培养基中，并以105个细胞/孔的密度在12孔板中接种。将细胞置于培养箱（5%CO 2,37°C）中，培养至少24小时而不干扰。
  2. 用 0.5 mL PBS 洗涤细胞并加入 250 μL 胰蛋白酶-EDTA （0.25%）。将细胞放回培养箱（5%CO 2,37°C）2分钟。
  3. 加入 1 mL 培养基以阻止细胞解离。向细胞中加入培养基，通过上下移液将它们从培养皿中分离出来，并将它们收集在 1.5 mL 管中。将细胞离心5分钟（100× g）。
  4. 除去上清液并将细胞重悬于 1 mL PBS 中。将细胞离心5分钟（100× g）。再次重复此步骤。
  5. 用 3% 牛血清白蛋白 （BSA） 将异硫氰酸荧光素 （FITC） 偶联的 PD-L1 抗体稀释至 20 nmol/L。 加入细胞并在 4 °C 下孵育 1 小时。
  6. 将细胞离心5分钟（100× g），然后用冷PBS洗涤两次。使用流式细胞仪和分析软件分析PD-L1阳性细胞。

5. 免疫细胞化学

  1. 将U87MG细胞接种在玻璃底细胞培养皿（35mm）中，密度为每孔2.5×105 个细胞。当达到 60% 的汇合度时，吸出培养基并加入 1 mL PBS。轻轻摇晃几次，然后吸气。执行洗涤步骤 3 次。
  2. 在培养皿中加入 500 μL 4% 多聚甲醛。将细胞置于室温下并固定30分钟。
  3. 用PBS洗涤细胞3次。加入 1 mL 3% BSA（wt/vol，PBS 中），并在室温下封闭固定细胞 2 小时。
  4. 除去3%BSA，并将细胞与一抗PD-L1抗体（mAb，1:100，在3%BSA中稀释）在4°C下直接孵育过夜。
    注意:用BSA封闭细胞后，不要用PBS洗涤。
  5. 用 3% BSA 缓冲液洗涤细胞 3 次。将细胞与FITC偶联的抗人IgG Fc二抗（1:500，在PBS中稀释）孵育1小时。
  6. 用PBS洗涤细胞3次。向细胞中加入 0.5 mL DAPI （1 μg/mL），并在室温下孵育 1 小时。用PBS洗涤染色的细胞3次，并使用共聚焦荧光显微镜观察。

6. 细胞摄取与抑制实验

  1. 细胞摄取实验
    1. 在 12 孔板中培养 U87MG 细胞，直至达到 80% 汇合度。取出培养基并用 0.5 mL PBS 洗涤细胞。
    2. 在新鲜培养基中将 [68Ga]DPA 稀释至 74 KBq/mL 浓度。向每个孔中加入 0.5 mL 稀释的 [68Ga]DPA 缓冲液。
    3. 将细胞与[68Ga] DPA在37°C下孵育不同持续时间（10,30,40和120分钟）。使用移液管吸出培养基。用PBS（0.5mL）洗涤细胞三次。
    4. 加入NaOH溶液（0.5 M，每孔300μL）裂解细胞。30 秒后，将粘性细胞裂解物收集在 1.5 mL 管中。
    5. 用 0.4 mL PBS 洗涤板两次。将洗涤液收集在上述 1.5 mL 管中。
    6. 启动自动伽马计数器内置电脑;将试管放入内置架子中。将所有样品装载到传送带上后，按 START 按钮。结果在内部软件中计算。读数记录每分钟衰减相关计数 （CPM）。
  2. 竞争性结合测定
    1. 在 12 孔板中培养 U87MG 细胞，直至达到 80% 汇合度。取出培养基并用 0.5 mL PBS 洗涤细胞。
    2. 在新鲜培养基中将 [68Ga]DPA 稀释至 74 KBq/mL 浓度。将适量的BMS202化合物溶解在10%DMSO中，得到10mM浓度（400μL）。
    3. 在 396 μL PBS 中稀释 4 μL 10 mM BMS202，以获得 100 μM 的浓度。 重复此步骤以产生各种浓度的 BMS202（1 μM、10 nM、100 pM 和 1 pM）。
    4. 向每个孔中加入 0.5 mL 稀释的 [68Ga]DPA 缓冲液（每孔 0.37 MBq）。向每个孔中加入 5 μL BMS202 溶液（每个浓度 3 个孔）。将细胞在37°C的细胞培养箱中孵育120分钟。
    5. 使用移液管吸出培养基。用 3 x 0.5 mL PBS 洗涤细胞。
    6. 加入NaOH溶液（0.5 M，每孔300μL）裂解细胞。30 秒后，将粘性细胞裂解物收集到 1.5 mL 管中。用 2 x 0.4 mL PBS 洗涤板。
    7. 将洗涤液收集在上述 1.5 mL 管中。将试管放入自动伽马计数器的内置架子中。
    8. 按照与步骤 6.1.6 相同的步骤操作。

7. PET成像

注意:使用微型 PET 扫描仪进行小动物 PET 成像，该扫描仪提供 159 个横向轴向切面，间隔 0.796 毫米（中心到中心），水平视野为 10 厘米，轴向视野为 12.7 厘米。在列表模式下收集的所有数据都组织成三维正弦图。然后将傅里叶重新组合成二维正弦图（帧×分钟:4 × 1、8 × 2、8 × 5）。

  1. 在本研究中使用雄性 5-8 周龄的 BALB/C 裸鼠。按照步骤 4.1-4.4 收集 U87MG 细胞并将细胞吸入 0.5 mL 注射器中。皮下注射细胞到小鼠体内（每个肿瘤1×10 6 个细胞，每只小鼠两个肿瘤）。注射后监测肿瘤生长，直到肿瘤体积为100-300mm3。
  2. 使用1%-2%（v / v）异氟醚（1mL / min）麻醉小鼠。打开加热装置，将PET的动物床保持在37°C。
  3. 将麻醉的小鼠放在PET机的动物床上的正确位置。将眼药膏涂抹在双眼上，以防止干燥。
    注意:将小鼠保持在俯卧位，以避免在扫描过程中死亡。在整个成像过程中，使用预装的管 通过 鼻子给予异氟烷流量（1.0 mL / min）。
  4. 通过控制面板调整动物床的位置。通过预装的尾静脉导管静脉注射示踪剂（10-17 MBq / 100-200μL）。
  5. 使用参考软件在主机中创建扫描工作流（请参阅 材料表） 创建研究文件夹并根据制造商的协议设置采集协议。在 3D列表模式下对所有鼠标执行动态扫描（每只鼠标60分钟）。
  6. 按照制造商的协议定义直方图协议和重建协议。使用奈奎斯特截止值为 0.5 周期/像素的 Hanning 滤波器，通过滤波后背投重建 PET 动态图像（25-30 分钟和 55-60 分钟）。为所有小鼠生成最大强度投影 （MIP） 图像。
  7. 将协议组合到工作流中并运行工作流。按照制造商的协议，使用软件分析生成的三维图像。
    注意:使用模拟软件选择感兴趣的体积。放射性根据注射时间进行衰变校正，并表示为总注射剂量/每克组织的百分比（% ID/g）。

8. 离体 生物分布

  1. 通过尾静脉注射给予携带U87MG的BALB / C裸鼠[68Ga]DPA（1.85 MBq / 100μL）。用1%-2%（v / v）异氟醚（1mL / min）麻醉小鼠，然后在注射5,30,60和120分钟后通过宫颈脱位处死三只小鼠。
    注意:演示此程序的个人应接受颈椎脱位技术技能的培训，以确保迅速诱发意识丧失。这将确保本实验中的安乐死程序都是人道的。
  2. 确认死亡后，打开小鼠的胸壁。然后，敞开心扉。使用 1 mL 注射器抽血;将注射器中的血液挤压到放射免疫测定 （RIA） 管（直径 13 mm）中，用于伽马计数器。
  3. 切除主要器官和肿瘤，并将它们放入 RIA 管（直径 13 毫米）中用于伽马计数器。主要器官包括全血、心脏、胸腺、肝脏、脾脏、骨骼、胃、肾脏、肌肉、肠淋巴结、小肠、胰腺、睾丸、脑和肺。称量所有器官。
  4. 使用自动伽马计数器测量收集器官内的放射性，并对值进行衰变校正。计算每克湿组织的注射剂量百分比（% ID / g）。

9. 免疫组化

  1. 收集胶质瘤组织并用PBS清洗3次。将新鲜组织置于4%多聚甲醛中，并在4°C下固定过夜。
  2. 将固定组织嵌入石蜡中，并将其切成10μm的厚度。将切片置于培养箱（60°C）中并孵育2小时。通过在以下各孵育10分钟来脱蜡和水合:二甲苯（两次），无水酒精，95%酒精，90%酒精，80%酒精，75%酒精。
  3. 将切片放入0.01M柠檬酸钠中，加热至92-95°C。 保持温度40分钟，实现抗原修复。
  4. 向切片中加入200μLH2O2 溶液（3%），并在室温下灭活内过氧化物酶10分钟。通过在室温下用3%BSA处理2小时来阻断非特异性位点。
  5. 将一抗PD-L1抗体（mAb，1:100，用3%BSA稀释）中的切片在4°C下孵育过夜。
    注意:用 BSA 阻塞后，不要用 PBS 清洗。
  6. 用 PBS 清洗部分 3 次。将切片与HRP标记的山羊抗兔二抗（1:500，在PBS中稀释）在室温下孵育1小时。
  7. 用PBS洗涤细胞3次。向切片中加入200μL3,3-二氨基联苯胺（DAB）工作溶液（溶液A:溶液B:溶液C = 1:1:18），并在黑暗中孵育5分钟。
  8. 用 PBS 清洗部分 3 次。加入500μL苏木精溶液（100%），在室温下孵育5分钟。用水清洗切片 30 秒。将切片放入分化溶液（75%酒精:HCL = 99:1）中30秒。用水清洗切片 1 分钟。
  9. 通过依次用75%酒精，80%酒精，90%酒精，95%酒精，无水酒精和二甲苯（两次）（每次10分钟）孵育来使样品脱水。使用中性树脂安装所有部分，并在光学显微镜下观察它们。

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结果

[68Ga]DPA 放射性标记和稳定性
模型肽 DPA 是一种有效的 PD-L1 拮抗剂。DOTA-DPA纯度>95%，收率为68%。实验观察到DOTA-DPA的质量为1,073.3（[M+2H]2+）。 68镓被认为是一种合适的放射性核素，用于标记用于 PET 成像的肽，因此被选为本研究对象。为了用 68Ga（半衰期:68分钟）对DPA进行放射性标记，合成了DOTA-PEG3-DPA（图1A

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讨论

该方法中描述的关键步骤包括将 68Ga 有效标记为 DPA，并选择合适的 PET 成像时间窗口，该时间窗口必须与肿瘤中 DPA 的药效学模式完全匹配。

与 IHC 相比，PET 成像能够以无创方式实时检测全身 PD-L1 表达，从而可以可视化异质性肿瘤中的每个阳性区域 6,7。选择肽作为配体，以避免抗体和小分子的缺点。大分子量的抗体一般循...

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披露声明

没有宣布任何竞争利益。

致谢

本研究得到了中国医学科学院非营利性中央研究所基金（编号:2022-RC350-04）和中国医学科学院医学科学创新基金（编号:2021-I2M-1-026、2022-I2M-1-026-1、02120101、02130101和2022-I2M-2-002）的支持。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA)Merck60239-18-168Ga  chelation
3,3-diaminobenzidine (DAB) KitSigma-AldrichD7304-1SETImmunohistochemistry
anti-PD-L1 monoclonal antibodyWuhan Proteintech17952-1-apImmunohistochemistry: primary antibody
BMS202Selleck1675203-84-5Competitive binding assay: inhibitor
BSAMerckV900933Immunofluorescent : blocking 
DAPIMerckD9542Immunofluorescent: staining of nucleus
Dichloromethane (DCM)Merck34856Solvent
DIPEAMerck3439Peptide coupling
EDC·HClMerckE6383Activation of DOTA
FBSGibco10099Cell culture: supplement
FITC-conjugated anti-human IgG Fc AntibodyBiolegend409310Immunofluorescent: secondary antibody
FITC-conjugated anti PD-L1 antibodyBiolegend393606Flow cytometry: direct antibody
HCTUEnergy ChemicalE070004-25gPeptide coupling
HRP labeled goat anti-rabbit antibodyServicebioGB23303Immunohistochemistry: secondary antibody
Hydroxysuccinimide (NHS)Merck130672Activation of DOTA
MeCNMerckPHR1551Solvent
MorpholineMerck8.06127Fmoc- deprotection
NMPMerck8.06072Solevent
ParaformaldehydeMerck30525-89-4Fixation of tissues
PBSGibco10010023Cell culture: buffer
Penicillin-streptomycin Gibco10378016Cell culture: supplement
RIA tubePolyLabP10301AAs tissue sample container
RPMI-1640 mediumGibco11875093Cell culture: basic medium
Sodium acetateMerck1.06264Salt for buffer
Trypsin-EDTAGibco25200056Cell culture: dissociation agent
U87MG cell lineProcell Life Science & Technology CoCL-0238Cell model
Equipment
68Ge/68Ga generatorIsotope Technologies Munich, ITMNot applicableGeneration of [68Ga]
Autogamma counterPerkin Elmer Wizard2Detection of radioactivity
Confocal fluorescent microscopyKeyenceObservation of immunofluorescent results
Flow cytometerBecton Dickinson, BDLSRIIMonitoring the PD-L1 positive cells
High-performance liquid chromatography (HPLC)SHIMAZULC-20AT Purification of DPA peptide
PET scannerSiemens Medical SolutionsInveon MultiModality SystemPET imaging
Optical microscopyNikon Eclipse E100Observation of immunohistochemistry results
Solid phase peptide synthesizerPromega Vac-Man Laboratory Vacuum ManifoldLOT#11101Synthesis of DPA-DOTA peptide
Software
ASIProSiemens Medical SolutionsNot applicableAnalysis of PET-CT results
FlowJoBecton Dickinson, BDFlowJo 7.6.1Analysis of the flow cytometer results
Inveon Acquisition Workplace (IAW)Siemens Medical SolutionsNot applicableManagement of PET mechine
PrismGraphpadPrism 8.0Analysis of the data 

参考文献

  1. Doroshow, D. B., et al. PD-L1 as a biomarker of response to immune-checkpoint inhibitors. Natire Reviews Clinical Oncology. 18 (6), 345-362 (2021).
  2. Krutzek, F., Kopka, K., Stadlbauer, S. Development of radiotracers for imaging of the PD-1/PD-L1 axis. Pharmaceuticals. 15 (6), 747(2022).
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