斯普拉格道利大鼠脂肪组织间充质干细胞的分离和鉴定

摘要

该协议描述了从Sprague Dawley大鼠中分离和鉴定脂肪组织来源的间充质干细胞（MSCs）的方法。

摘要

近几十年来，成人间充质细胞彻底改变了分子和细胞生物学。它们可以分化成不同的特化细胞类型，此外还有强大的自我更新、迁移和增殖能力。脂肪组织是间充质细胞侵入性最小、最容易获得的来源之一。据报道，与其他来源相比，它具有更高的产量，以及优越的免疫调节特性。最近，已经发表了从不同组织来源和动物物种获得成年间充质细胞的不同程序。在评估了一些作者的标准后，我们标准化了一种适用于不同目的且易于复制的方法。来自肾周和附睾脂肪组织的基质血管分数（SVF）池使我们能够开发具有最佳形态和功能的原代培养物。观察到细胞粘附在塑料表面上24小时，并表现出成纤维细胞样形态，具有延长和形成集落的趋势。流式细胞术（FC）和免疫荧光（IF）技术用于评估膜标志物CD105，CD9，CD63，CD31和CD34的表达。脂肪来源的干细胞（ASCs）分化成成脂肪谱系的能力也使用多种因素（4μM胰岛素，0.5mM 3-甲基异丁基黄嘌呤和1μM地塞米松）进行评估。48小时后，观察到成纤维细胞样形态逐渐丧失，并且在12天时，确认存在对油红色染色阳性的脂滴。总之，提出了一种程序来获得最佳和功能性ASC培养物以应用于再生医学。

引言

间充质干细胞（MSCs）因其自我更新，增殖，迁移和分化为不同细胞谱系的高能力而强烈影响再生医学^1，2。目前，大量的研究集中在它们治疗和诊断各种疾病的潜力上。

间充质细胞有不同的来源：骨髓、骨骼肌、羊水、毛囊、胎盘和脂肪组织等。它们是从不同的物种获得的，包括人类、小鼠、大鼠、狗和马³.骨髓来源的间充质干细胞（BMSC）多年来一直被用作再生医学中干细胞的主要来源，并作为^{胚胎干细胞使用的}替代品4。然而，脂肪来源的MSCs或脂肪来源的干细胞（ASCs）是一种重要的替代品，由于其易于收集和分离，以及每克^{脂肪组织获得}的细胞产量5，^6，具有很大的优势。据报道，ASC的收获率普遍高于^BMSCs7。最初提出ASC的修复/再生能力是由于它们分化成其他细胞谱系的能力^8。然而，近年来的研究加强了ASC释放的旁分泌因子在其修复潜力中的主要作用^9，10。

研究方案

所有实验程序均按照墨西哥动物护理指南进行，该指南基于国际实验动物护理评估和认证协会（墨西哥官方规范NOM-062-200-1999，墨西哥）的建议。该协议由墨西哥社会研究所健康研究伦理委员会审查、批准和注册 （R-2021-785-092）。

1.通过手术切除从大鼠身上去除脂肪组织

1. 用 20 mL 无菌 1x 磷酸盐缓冲盐水-抗生素抗真菌剂 （PBS-AA） 溶液（1 x PBS、庆大霉素 [20 μg/mL] 和两性霉素 [0.5 μg/mL]）制备两个锥形管，并保持在冰上。
2. 选择两只健康状况良好的成年雄性Sprague Dawley大鼠 （R. norvegicus）。 确保大鼠在3-4个月大之间，体重为350-450克。
3. 用20mg / kg盐酸甲苯噻嗪进行镇静，5分钟后，腹膜内给予剂量为120mg / kg盐酸氯胺酮的麻醉剂。用眼药膏润滑双眼以防止干燥。然后，通过缺乏踏板反射确认麻醉深度。
4. 用碘溶液剃须和消毒腹部和腹股沟区域。使用手术单以保持无菌。然后，从胸骨到睾丸区域做一个正中纵向切口。
5. 用无菌镊子去除附睾和肾脏周围的脂肪组织，并放入1x PBS-AA溶液中。将样品放在冰上。
6. 如果需要，根据机构指南缝合切口，并用40mg / kg戊巴比妥钠的心内剂....

讨论

自发现间充质干细胞以来的过去四十年中，几组研究人员已经描述了从不同组织和物种获得间充质干细胞的程序。使用大鼠作为动物模型的优点之一是它们易于维护和快速发育，以及易于从脂肪组织获得MSC。已经描述了用于获得ASC的不同组织来源，例如内脏，肾周，附睾和皮下脂肪¹²，¹³，^14，15，16。.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	HyClone	SV30078.01
Analytical balance	Sartorius	AX224
Antibody anti- CD9 (C-4)	Santa Cruz	Sc-13118
Antibody anti-CD34 (C-18)	Santa Cruz	Sc-7045
Antibody anti-C63	Santa Cruz	Sc-5275
Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594	Santa Cruz	Sc-18838A594
Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680	Santa Cruz	Sc-18916AF680
Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3	Novus	NB 120-6939
Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550	Invitrogen	SA5-10087
Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´)	RD Systems.	No. F103B
Bottle Top Filter Sterile	CORNING	10718003
Cell and Tissue Culture Flasks	BIOFIL	170718-312B
Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides	SIGMA Aldrich	Z359629
Cell wells: 6 well with Lid	CORNING	25810
Centrifuge conical tubes	HeTTICH	ROTANA460R
Centrifuge eppendorf tubes	Fischer Scientific	M0018242_44797
Collagen IV	Worthington	LS004186
Cryovial	SPL Life Science	43112
Culture tubes	Greiner Bio-One	191180
CytExpert 2.0	Beckman Coulter	Free version
CytoFlex LX cytometer	Beckman Coulter	FLOW-2463VID03.17
DMEM	GIBCO	31600-034
DMSO	SIGMA Aldrich	67-68-5
DraQ7 Dye	Thermo Sc.	D15106
EDTA	SIGMA Aldrich	60-00-4
Eosin yellowish	Hycel	300
Ethanol 96%	Baker	64-17-5
Falcon tubes 15 mL	Greiner Bio-One	188271
Falcon tubes 50 mL	Greiner Bio-One	227261
Fetal Bovine Serum	CORNING	35-010-CV
Gelatin	SIGMA Aldrich	128111163
Gentamicin	GIBCO	15750045
Glycerin-High Purity	Herschi Trading	56-81-5
Hematoxylin	AMRESCO	0701-25G
Heracell 240i CO2 Incubator	Thermo Sc.	50116047
Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate)	Aranda	SV057430
L-Glutamine	GIBCO/ Thermo Sc.	25030-081
LSM software Zen 2009 V5.5		Free version
Biological Safety Cabinet Class II	NuAire	12082100801
Epifluorescent microscope	Zeiss Axiovert 100M	21.0028.001
Inverted microscope	Olympus CK40	CK40-G100
Non-essential amino acids 100X	GIBCO	11140050
Micro tubes 2 mL	Sarstedt	72695400
Micro tubes 1,5 mL	Sarstedt	72706400
Micropipettes 0.2-2 μL	Finnpipette	E97743
Micropipettes 2-20 μL	Finnpipette	F54167
Micropipettes 20-200 μL	Finnpipette	G32419
Micropipettes 100-1000 μL	Finnpipette	FJ39895
Nitrogen tank liquid	Taylor-Wharton	681-021-06
Paraformaldehyde	SIGMA Aldrich	SLBC3029V
Penicillin / Streptomycin	GIBCO/ Thermo Sc.	15140122
Petri dish Cell culture	CORNING Inc	480167
Pipet Tips	Axygen Scientific	301-03-201
Pisabental (pentobarbital sodium)	PISA Agropecuaria	Q-7833-215
Potassium chloride	J.T.Baker	7447-40-7
Potassium Phosphate Dibasic	J.T Baker	2139900
S1 Pipette Fillers	Thermo Sc	9531
Serological pipette 5 mL	PYREX	L010005
Serological pipette 10 mL	PYREX	L010010
Sodium bicarbonate	J.T Baker	144-55-8
Sodium chloride	J.T.Baker	15368426
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	J.T Baker	7558-79-4
Sodium pyruvate	GIBCO BRL	11840-048
Syringe Filter Sterile	CORNING	431222
Spectrophotometer	PerkinElmer Lambda 25	L6020060
Titer plate shaker	LAB-LINE	1250
Transfer pipets	Samco/Thermo Sc	728NL
Trypan Blue stain	GIBCO	1198566
Trypsin From Porcine Pancreas	SIGMA Aldrich	102H0234
Tween 20	SIGMA Aldrich	9005-64-5
Universal Blocking Reagent 10x	BioGenex	HK085-GP
Xilapet 2% (xylazine hydrochloride)	Pet's Pharma	Q-7972-025