小鼠新生儿脑的显微CT成像和形态分析

摘要

本研究描述了通过结合显微计算机断层扫描 （micro-CT） 和造影剂在 离体 样本中获得新生小鼠大脑高分辨率图像的步骤。我们描述了基本的形态测量分析，以量化这些图像中的大脑大小和形状。

摘要

神经图像是使用动物模型在实验中研究大脑形态的宝贵工具。磁共振成像（MRI）已成为软组织的标准方法，尽管其低空间分辨率对小动物造成了一些限制。在这里，我们描述了一种使用显微计算机断层扫描（micro-CT）获取小鼠新生儿大脑和颅骨的高分辨率三维（3D）信息的方案。该协议包括解剖样本、染色和扫描大脑以及获得整个器官和感兴趣区域 （ROI） 的形态测量值所需的步骤。图像分析包括结构的分割和点坐标的数字化。总之，这项工作表明，将micro-CT和Lugol溶液作为造影剂的组合是小动物围产期大脑成像的合适替代方案。这种成像工作流程在发育生物学、生物医学和其他科学中都有应用，这些科学对评估各种遗传和环境因素对大脑发育的影响感兴趣。

引言

显微计算机断层扫描 （micro-CT） 成像是不同研究领域的宝贵工具。在生物学中，由于X射线在矿化组织中的吸收，它特别适用于骨骼研究。由于这一特点，在显微CT的帮助下，已经解决了有关骨骼发育¹、代谢²和进化^3,4等主题的各种问题。2008 年，de Crespigny 等人 ⁵ 表明，使用碘作为造影剂可以获得成年小鼠和兔子大脑的显微 CT 图像。这项工作为这种成像技术开辟了新的应用，因为碘允许从软组织获取图像，否则这些图像对X射线不敏感。因此，将显微CT和碘造影剂相结合的总体目标是获得高分辨率图像，其中可以在中观或宏观解剖学水平上区分和识别软组织。

该技术在需要对小标本（如小鼠胚胎）进行详细的离体表型表征的研究方面具有显着的潜力，这些标本广泛用于实验设计⁶。碘造影剂与显微 CT 成像相结合已用于获得器官⁷ 和标志性三维 （3D） 结构 ^8,9 的....

研究方案

所有实验程序均遵循加拿大动物护理委员会的指导方针。

1. 样品采集和制备

1. 制备 500 mL 4% 多聚甲醛 （PFA）。
   1. 在柜中的萃取助焊剂下，将 20 g PFA 粉末加入 1 L 玻璃烧杯中的 250 mL 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中。将带有磁铁的烧杯放在磁力搅拌板上。
   2. 加热时搅拌。使用温度计，不断检查溶液的温度，使其保持在60°C以下。
   3. 用塑料巴斯德移液管，向溶液中加入1M NaOH滴以溶解PFA。PFA粉末完全溶解后，在室温（RT）下冷却溶液。
   4. 用 1x PBS 将体积调节至 500 mL。用塑料巴斯德移液管加入1M HCl滴，将pH调节至7.2-7.3。
   5. 使用纸过滤器和玻璃漏斗，过滤 1 L 玻璃瓶中的溶液。
   6. 关闭玻璃瓶，将其从助焊剂柜中取出，并存放在-4°C的冰箱中。
2. 收集大脑样本。
   1. 为了获得样本，在出生后的早晨，在0.5天大的小鼠新生儿（P 0.5）处死，使用手术剪刀将其斩首。
   2. 将剪刀放在新生儿的脖子上，同时握住身体，然后进行一次干净的剪裁。
3. 将样品固定在PFA中。
   1. 用 40 mL 4% PFA 填充 50 mL 锥形管。
   <....

结果

本文介绍了获得新生小鼠大脑高分辨率图像的基本方案。浸入 Lugol 溶液后扫描头部。尽管它们的体积很小，但可以区分主要的大脑解剖结构，如嗅球、皮层、中脑、小脑和后脑（图1）。

可以使用这些图像作为输入进行不同的分析。对两个不同解剖平面上的一组地标和半地标进行了数字化。如 图 2 所示，点沿大脑边界放置在所选?.......

讨论

在这项工作中，介绍了一种使用显微CT和造影剂扫描小鼠新生儿脑组织的简明方案。此外，它还包括获得定量和定性输出的简单程序。在这些方法的基础上，可以进行进一步的替代或补充分析。

如协议所示，可以通过不同的方式分析显微CT图像。在之前的研究中，我们小组通过数字化点坐标和应用几何形态测量技术来估计小鼠围产期大脑的大小和形状变化

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
µCT 35	Scanco Medical AG		Note that Scanco does not offer the  µCT 35 anymore. Their smallest scanner is now the  µCT 45
Avizo	Visualization Sciences Group, VSG
C57BL/6 Mice	Bioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata
Conical tubes	Daigger	CH-CI4610-1856
Flux cabinet	Esco	AC2-458
Glass beaker	Glassco	GL-229.202.10
Glass bottle	Simax	CFB017
Glass funnel	HDA	VI1108
HCl	Carlo Erba	403872	Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
I2	Cicarelli	804211	When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
KI	Cicarelli	PA131542.1210	When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Magnetic stirring	Arcano	4925
NaOH	Cicarelli	1580110	Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Orbital shaker	Biomint	BM021
Paraformaldehyde	Biopack	2000959400	Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Paton spatula	Glassco	GL-377.303.01
PBS	Biopack	2000988800
Plastic Pasteur pipette	Daigger	9153
R	R Project		The package geomorph for R was used in the protocol (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html)
Scissors	Belmed
Sodium azide	Biopack	2000163500
Thermometer	Daigger	7650