从新鲜组织中建立胰腺癌来源的肿瘤类器官和成纤维细胞

摘要

肿瘤类器官彻底改变了癌症研究和个性化医疗方法。它们代表了一种临床相关的肿瘤模型，使研究人员能够在临床上领先于肿瘤。该方案从新鲜的胰腺肿瘤组织样本和胰腺癌来源的患者来源的异种移植物中建立肿瘤类器官。

摘要

肿瘤类器官是三维 （3D） 离体 肿瘤模型，可概括原始原发肿瘤组织的生物学关键特征。患者来源的肿瘤类器官已用于转化癌症研究，可用于评估治疗敏感性和耐药性、细胞间相互作用以及肿瘤细胞与肿瘤微环境的相互作用。肿瘤类器官是复杂的培养系统，需要先进的细胞培养技术和具有特定生长因子混合物和模拟细胞外环境的生物基底膜的培养基。建立原发性肿瘤培养的能力很大程度上取决于肿瘤的起源组织、细胞性和临床特征，例如肿瘤分级。此外，组织样本采集、材料质量和数量以及正确的生物样本库和储存是该程序的关键要素。实验室的技术能力也是需要考虑的关键因素。在这里，我们报告了一种经过验证的 SOP/方案，该方案在技术和经济上是可行的，可用于从胰腺癌来源的新鲜组织样本中培养离体肿瘤类器官，无论是来自新鲜的原发性切除的患者供 体 组织或患者来源的异种移植物 （PDX）。本文描述的技术可以在具有基本组织培养和小鼠设施的实验室中进行，并且是为转化肿瘤学领域的广泛应用而量身定制的。

引言

肿瘤类器官是体外三维 （3D） 组织培养物，来源于新鲜肿瘤组织并提供癌症模型。肿瘤类器官概括了原始原发肿瘤¹、²、^3、4 的生物学关键特征，可以扩增长达数月并冷冻保存，类似于传统的永生化细胞系。肿瘤类器官为转化/^{个性化医学提供了}患者来源的肿瘤模型的生物库5，代表了癌细胞生物学系统/模型的重要进展。患者来源的肿瘤类器官可用作离体模型，以预测（新）辅助肿瘤/药物治疗的疗效，从新鲜肿瘤组织建立培养物，并在患者特异性的基础上进行药物敏感性测定或药物分型，以确定后续治疗线的有效药物^1,4.此外，肿瘤类器官克服了原发肿瘤组织可用性的限制，更重要的是，它为体内小鼠模型（如患者来源的异种移植物 （PDX）²））提供了极好的替代或补充系统。如果原发性肿瘤细胞与肿瘤微环境 （TME） 中发现的基质细胞（例如癌症相关成纤维细胞 （CAF）、内皮细胞和免疫细胞）结合，则肿瘤类器官的复杂性会增加，这些细胞模仿原发肿瘤的功能和复杂细胞性。已使....

研究方案

所有程序均按照马德里自治大学伦理委员会（CEI 103-1958-A337）和马德里自治大学（PROEX 294/19）批准的实验动物福利机构指南进行，并符合《涉及动物的生物医学研究的国际指导原则》中规定的动物护理和使用道德行为准则， 由国际医学科学组织理事会（CIOMS）开发。该协议遵循具有书面知情同意书的生物医学研究的伦理原则。使用新鲜组织建立肿瘤类器官培养物已获得事先伦理批准。样本由 Ramón y Cajal-IRYCIS 生物样本库医院（国家生物样本库 B.0000678 登记处）提供，整合到 ISCIII 的生物样本库和生物模型平台 （PT20/00045） 中，并按照标准操作程序进行处理，并获得适当的伦理批准。如前所述，将肿瘤皮下植入免疫功能低下的 6 周龄雌性 NU-Foxn1nu 裸鼠中（参见材料表），并在体内传代以建立 PDAC PDX。

1.实验准备

1. 在 II 类生物安全柜中处理人体样本。
2. 在整个手术过程中穿好实验服、戴防护手套和眼镜，以避免被组织传播的病原体感染。
   注意：处理新鲜组织样品并铺板类器官和成纤维细胞至少需要 3 小时。
3. 在收获后最多24小时内处理新鲜组织样品²² ，并在4°C下储存在组织培养基（补....

讨论

药物癌症治疗的重大进展具有挑战性，因为药物在I期肿瘤临床试验中获得批准的可能性为5.1%，是所有疾病类型中最低的²³。主要原因是癌症的异质性很强，因此，患者队列对给定治疗的反应并不一致，这凸显了需要一种更加个性化的方法。二维 （2D） 培养物已用于转化癌症研究多年，但缺乏原发性肿瘤中发现的结构性 3D 组织。因此，它们不能准确反映患者治疗反应和肿瘤细胞?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well Costar Ultra-low Attachment plates	Biofil	TCP011006
70 μm pore strainer	VWR	732-2758
Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer	Gibco	A10492-01
Amphotericin B	Gibco	15290018
Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC)	Nuaire	NU-4750E
Cell recovery solution	Corning	354253
Collagenase IV	Gibco	17104019
DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES	Gibco	31330-038
DNase	Roche	10104159001
Fetal Bovine Serum (FBS)	Corning	35-079-CV
Freezing container, Nalgene	Merck	C1562
gentleMACS Octo Dissociator	Milteny Biotec	130-096-427
HEPES	Gibco	15630056
Human Placenta Growth Factor (PlGF)	enQuireBio	QP6485-EC-100UG
Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice	Janvier, France
Insulin-like growth factor-1 (IGF-1)	Invitrogen	RP10931
L-Glutamine	Corning	354235
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	356234
Normocin	InvivoGen	ant-nr-2
Pasteur pipettes	Deltalab	200007
Penicillin Streptomycin Solution (100x)	Corning	30-002-CI
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Corning	21-040-CV
Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	Gibco	PHG0026
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Gibco	PHG0311
ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL	72304
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Gibco	A1110501
Surgical Blades	Nahita	FMB018
Trypsin	Gibco	25300054