可见光光学相干断层扫描光纤图与同一小鼠视网膜的共聚焦图像的对齐

摘要

本方案概述了 将 体内可见光光学相干断层扫描纤维成像（vis-OCTF）图像与同一小鼠视网膜的 离体 共聚焦图像对齐的步骤，以验证 在体内 图像中观察到的视网膜神经节细胞轴突束形态。

摘要

近年来， 活体 视网膜成像提供了关于生物系统和过程的无创、实时和纵向信息，越来越多地用于客观评估眼部疾病的神经损伤。同一视网膜的 离体 共聚焦成像通常是必要的，以验证 体内 发现，尤其是在动物研究中。在这项研究中，我们展示了一种将小鼠视网膜 的离体 共聚焦图像与其 体内 图像对齐的方法。一种新的临床成像技术称为可见光光学相干断层扫描纤维成像（vis-OCTF），用于获取小鼠视网膜的 活体 图像。然后，我们对与“金标准”相同的视网膜进行了共聚焦成像，以验证 体内 与OCTF图像的对比。这项研究不仅能够进一步研究分子和细胞机制，而且为灵敏客观地评估 体内神经损伤奠定了基础。

引言

视网膜神经节细胞 （RGC） 在视觉信息处理中起着关键作用，通过其在内丛状层 （IPL） 中的树突树接收突触输入，并通过它们在视网膜神经纤维层 （RNFL） 中的轴突将信息传递到大脑 1,2,3,4。在青光眼等疾病中，早期 RGC 变性可能导致患者和啮齿动物模型 RNFL、神经节细胞层 （GCL）、IPL 和视神经的细微变化 5,6,7,8,9。因此，及早发现RGC的这些形态变化对于及时干预以防止RGC和视力丧失至关重要。

我们最近开发了一种新的临床成像技术，称为可见光光学相干断层扫描（vis-OCT），以满足RGC损伤的体内监测需求。Vis-OCT 提高了轴向分辨率，在视网膜中达到 1.3 μm^10,11，允许可视化 RNFL 中的单个 RGC 轴突束。随后，建立了 vis-OCT 纤维成像 （vis-OCTF） 来跟踪和量化小鼠¹¹、^12、13 中单轴突束水平的 RGC 损伤。然而，通常需要对与金标准相同的视网膜进行离体共聚焦成像，以验证体内发现。因此，本研究将演示如何将 vis-OCTF 获取的体内图像与同一小鼠视网膜的离体共聚焦图像对齐。该协议旨在通过离体共聚焦成像验证体内发现，并为检查疾病条件下 RGC 损伤的分子和细胞变化奠定基础。

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研究方案

所有动物程序均由弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院 （NIH） 的动物使用指南。有关本协议中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参阅 材料表 。

1. 体内 vs-OCT成像

1. vis-OCT 系统
   1. 使用使用超连续光源的小动物 vs-OCT 系统对小鼠眼睛进行成像，该系统提供 480 nm 和 650 nm 之间的可见光照明。确保角膜上的功率为 1 mW，并使用 25 kHz 的 A 线速率和每条 A 线 39.3 μs 的积分时间。
   2. 确保光谱仪的光谱检测范围在 508 nm 和 613 nm 之间，从而在视网膜中提供 1.3 μm 的轴向分辨率。总成像体积约为 700 μm （x） x 700 μm （y） x 1,500 μm （z）。横向分辨率在视场中心的 4.5 μm 和距中心 350 μm 的 8.7 μm 之间^11,13。
2. 小鼠麻醉
   1. 用腹膜内注射氯胺酮（114mg / kg）和甲苯噻嗪（17mg / kg）混合物麻醉C57BL / 6背景和任何性别的小鼠，并使用1%托吡卡胺滴剂扩张其瞳孔。通过用力捏脚趾后踏板反射丧失来确认充分麻醉。
   2. 在成像过程中，使用红外线加热灯保持鼠标温暖。每次图像采集后，应用人工泪液以防止角膜脱水。
3. 鼠标的定位以进行成像
   1. 将麻醉的鼠标放在动物支架上，并借助两条魔术贴带将鼠标保持在适当的位置。
      注意： 动物支架允许在三个维度上移动（垂直调整、精细水平调整以及俯仰和偏航调整），以将激光放入鼠标的眼睛。
4. 调整成像参数
   1. 打开计算机并打开参考软件，该软件将自动打开激光器。
   2. 调整动物支架，直到激光稳定并对准鼠标的眼睛。通过软件界面中的 En Face 预览、浅表血管丛的视野 （FOV） 和 B 扫描（视场内视网膜的横截面）可视化眼睛的后部。
   3. 在对光学焦点进行细微调整后，单击软件界面上的“获取”按钮 获取 vis-OCT 体积，该焦点包括 512 条 A 线/B 扫描和 512 条 B 扫描/体积。
      注意：此过程需要 ~10.5 秒。图像采集由内置的质量指数 （QI） 估计器引导，以确保不包括低于预定阈值 （QI < 45） 的图像。
      1. 对于每只小鼠，从同一只眼睛获取四个 vis-OCT 体积。将视神经头 （ONH） 对准 FOV 的四个角，以覆盖视网膜的不同区域。
         注意：这种放置使视网膜曲率最小化，从而最大限度地提高整个 FOV 的 RNFL 反射率。每次采集之间需要~1分钟才能重新定位眼睛（图1A，B）。
5. Vis-OCTF 分析
   注：MATLAB用于执行图像分析。
   1. 要从 vis-OCT 体积生成 vis-OCT 纤维图，请使用基于强度的阈值方法（MATLAB 代码行 808）检测视网膜表面。
      注意： 这些线使用 imadjust 函数来调整 bscan 的强度值。传递给 imadjust 的 [0.0087， 0.08] 参数指定要映射到输出图像的完整动态范围的强度范围。
   2. 通过选择第一个~16μm的深度来裁剪RNFL。参见 Matlab 代码行 782。
      注：成年野生型 C57BL/6 小鼠的 典型体内 RNFL 厚度为 ~14 μm，并且可能因不同的分割方法而异¹³。
   3. 更改 RAW 文件（第 9 行）、重建文件（第 11 行）和文件名（第 15 行）的路径，单击 “运行”，然后等待 MATLAB 代码分析 OCT 图像。计算沿轴向 （z） 方向（MATLAB 代码行 905-908）的平均强度投影，以生成由 RGC 轴突束和周围脉管系统组成的纤维图图像。通过将血管与所选的图形编辑器对齐，对每个 FOV 进行纤维图处理后的四张图像进行蒙太奇，总共覆盖 ~1.2 x 1.2 mm。RAW文件通常保存在OCT成像日期下的Halo Data文件夹中（例如，0606 Opticent）。
      注意：补充 文件 1 中提供了 MATLAB 代码。

2. 离体 共聚焦成像

1. 小鼠安乐死
   1. 在获得vis-OCT数据后，用戊巴比妥钠（390mg / mL）和苯妥英钠（50mg / mL）的混合物对小鼠实施安乐死。苯妥英钠通过放大戊巴比妥钠的作用发挥作用，戊巴比妥钠已广泛应用于啮齿动物安乐死^14,15。对于每只小鼠，使用 0.2 mL/20 g 稀释混合物 （156 mg/mL） 并灌注 20 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS），然后灌注 20 mL 4% 多聚甲醛 （PFA） 的 PBS^16,17 溶液。
2. 眼球解剖和定向
   1. 将眼睛摘除并在颞侧做一个标记以指示方向。
   2. 小心地取出前房，晶状体，玻璃体，并将眼罩固定在PFA中30分钟。
   3. 用PBS清洗眼罩30分钟，并在洗涤过程中更换PBS溶液3次。然后，用0.5%Triton X-100在PBS（pH 7.5）中洗涤30分钟。
   4. 在室温下将眼罩在封闭缓冲液（5%驴血清与2.5%牛血清白蛋白和0.5%Triton X-100在Tris缓冲盐水[pH 7.5]中）孵育2小时。
3. 免疫染色
   注意：眼罩现在可以用小鼠抗 Tuj1 的一抗染色以检测 RGC 轴突束和大鼠抗 ICAM-2 的一抗以检测血管。
   1. 将眼杯与一抗，小鼠抗Tuj1（在封闭缓冲液中1：200）和大鼠抗ICAM-2（在封闭缓冲液中1：500）在4°C孵育过夜。
   2. 用含有0.5%Triton X-100（PBST）的磷酸盐缓冲盐水溶液洗涤眼罩3-5次，每次1小时，以尽量减少背景并去除任何未结合的抗体。
   3. 洗涤后，将眼罩与二抗、与Alexa Fluor 488染料偶联的驴抗小鼠免疫球蛋白G（绿色荧光）和与Alexa Fluor 594染料偶联的驴抗大鼠IgG（红色荧光）孵育过夜，均在封闭缓冲液中以1：1000稀释，在4°C。
   4. 第二天，用PBST清洗眼罩3-5次，每次1小时，以尽量减少背景并去除未结合的抗体。
   5. 在平放之前，将眼罩转移到PBS的培养皿中。
4. 平面视网膜
   1. 免疫染色过程后，在显微镜下从眼罩中分离视网膜。
   2. 将视网膜切成四片叶子，然后平放，RGC层朝上。在附着在视网膜的颞侧留下标记以指示方向。
   3. 用封固剂^13,18 盖玻片视网膜。用指甲油¹³、^18、19 密封载玻片。
5. 共聚焦成像
   注：共聚焦图像的图像处理是使用ZEN显微镜软件进行的。
   1. 打开共聚焦显微镜，在 定位模式下，使用显微镜的目镜找到感兴趣的区域。
   2. 在 采集模式下，设置平铺以覆盖整个视网膜，设置 z 堆栈切片以覆盖所有信息层。在整个视网膜上至少对 25 个图块进行成像，以覆盖 5.99 毫米 （x） x 5.88 毫米 （y） x 30 μm （z） 的总体积，像素尺寸为 1.24 μm/像素。
   3. 投影Z-stack切片以创建二维面共聚焦显微镜图像（图1C，D）11,13,19,20,21。

3. 体内 和 离体 图像的比对

1. 处理纤维图后，通过将所有血管与所选的图形编辑器对齐，创建一个合成图像，其中包括从每只鼠标获取的四个图像。
   注：平均而言，最终合成图像约为 1.2 mm （x） x 1.2 mm （y）， 如图 1B 所示。
2. 使用视神经头 （ONH） 和血管模式作为标志来对齐复合纤维图。通过将复合OCT图像的血管模式与用ICAM-2染色的同一视网膜的共聚焦图像重叠来获得 体内 和 离体 对齐。

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结果

将复合 vs-OCT 纤维图与用 Tuj-1 免疫染色的 RGC 轴突的平面视网膜的相应共聚焦图像进行比较（图 1D，上图）。通过 vis-OCTF 成像的轴突束可以与共聚焦图像上的 Tu-j1 标记的轴突束相匹配。在纤维图图像中，与周围的轴突束相比，血管通常表现出可区分的分支结构，这可以与共聚焦图像上的ICAM-2标记的血管相匹配（图1D，下图）。

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讨论

该协议中有两个步骤需要注意。首先，有必要确保动物处于深度麻醉状态，并且在 vs-OCT 成像之前他们的眼睛完全散瞳。如果小鼠没有得到充分的麻醉，它们的快速呼吸可能导致 面部 图像的不稳定运动，这可能会对纤维图的质量产生不利影响。此外，扩张不足也会对图像质量产生负面影响，因为虹膜可能会阻挡光线，阻止光线到达视网膜。其次，在灌注后但从小鼠眼窝中取出眼球之前，标...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Halo 100	Opticent Health, Evanston, IL
Zeiss LSM800 microscope	Carl Zeiss
Drugs and antibodies
4% paraformaldehyde (PFA)	Santz Cruz Biotechnology, SC-281692		1-2 drops
Bovine serum albumin powder	Fisher Scientific, BP9706-100		1:10
Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye	Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202		1:1,000
Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye	Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209		1:1,000
Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL))	Covetrus, NDC 11695-4860-1		15.6 mg/mL
Ketamine	Covetrus, NADA043304		114 mg/kg
Mouse anti-Tuj1	A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia		1:200
Normal donkey serum(NDS)	Millipore Sigma, S30-100 mL		1:100
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 (Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4)	Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3		1:10
Rat anti-ICAM-2	BD Pharmingen, Cat#553325		1:500
Tropicamide drops	Covetrus, NDC17478-102-12
Triton X-100 (Reagent Grade)	VWR, CAS: 9002-93-1		1:20
Vectashield mounting medium	Vector Laboratories Inc. H2000-10
Xylazine	Covetrus, NDC59399-110-20		17 mg/kg