一种可视化胰腺癌细胞线粒体超微结构变化的三维技术

摘要

该协议描述了如何重建线粒体嵴以实现高精度，高分辨率和高通量的3D成像。

摘要

了解细胞器超微结构的动态特征，不仅具有丰富的未知信息，而且从三维（3D）角度来看也很复杂，对于机制研究至关重要。电子显微镜（EM）具有良好的成像深度，并允许重建高分辨率图像堆栈，以研究细胞器的超微结构形态，即使在纳米尺度上也是如此;因此，3D重建因其无与伦比的优势而变得越来越重要。扫描电子显微镜（SEM）提供了一种高通量图像采集技术，允许在连续切片中从相同的感兴趣区域重建3D大型结构。因此，SEM在大规模三维重建中的应用，以恢复细胞器的真实三维超微结构变得越来越普遍。在该协议中，我们建议结合连续超薄切片和3D重建技术来研究胰腺癌细胞中的线粒体嵴。该协议以逐步的方式描述了如何执行这些技术的详细信息，包括锇 - 硫代碳酰肼 - 锇（OTO）方法，连续超薄切片成像和可视化显示。

引言

线粒体是细胞中最重要的细胞器之一。它们是细胞生物能量学和代谢的中心枢纽^1,2，^并在癌症中起着关键作用³。胰腺癌（PC）由于其快速扩散和高死亡率，是最难治疗的癌症之一4。线粒体功能障碍主要由线粒体形态变化3,5,6,7引起^，与PC⁸的疾病机制有关。线粒体也是高度动态的，这反映在其网络连接和^嵴结构的频繁和动态变化上9。嵴结构的重塑可直接影响线粒体功能和细胞状态10,11，在肿瘤细胞生长、转移和肿瘤微环境变化过程中发生显著改变^12,13。

近年来，科学家们使用EM观察研究了这种细胞器

研究方案

1. 材料准备

1. 在12mL的DMEM培养基（10%胎牛血清和100U / mL青霉素 - 链霉素）中培养2 x 10⁶ Panc02细胞，并在5%二氧化碳和95%空气的气氛中保持在37°C和95%湿度48小时。
2. 收集Panc02细胞，以28× g 离心2分钟，然后弃去上清液。确保样品具有适当的大小（1 x 10⁷ 个细胞），否则，以下固定和脱水步骤将无法正常工作。
3. 加入1mL的2.5%戊二醛作为固定剂，将新鲜的Panc02细胞固定在4°C的1.5mL微量离心管中过夜。
   注意：在以下每个步骤（步骤1.3-1.11）中，样品需要在1,006× g 下离心5分钟。
4. 吸出固定剂，并用0.1M磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗样品两次，然后在室温下用双蒸水（ddH₂O）冲洗两次，每次10分钟。
5. 加入50μL含有1%四氧化锇（_{OsO 4}）和1.5%亚铁氰化钾的溶液，比例为1：1，在4°C下1小时。然后，用0.1M PBS冲洗两次，每次10分钟，并用ddH₂O冲洗10分钟。
6. 加入 1 mL 的 1% 硫代碳酰肼 （TCH），在室温下孵育 30 分钟至 1 小时，然后用 ddH₂O 冲洗四次，每次 10 分钟。

讨论

这里介绍的方法是一个有用的分步指南，用于应用3D重建技术，该技术涉及将电子显微镜和图像处理技术应用于从连续超薄切片生成的2D断层扫描图像的堆叠和分割。该协议强调了可以通过细胞器超微结构的3D可视化来解决的2D图像的局限性，该图像具有高分辨率水平上结构的强可重复性和更高的精度的优点。更重要的是，这种3D可视化可以应用于肿瘤细胞，使病理机制的研究更加直接可靠。在这项.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
(1S,3R)-RSL3	MCE	HY-100218A
Acetone	SIGMA	179124
Amira	Visage Imaging
Aspartic acid	MCE	HY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s medium	Gibco	11995115
Ethanol	Merck	100983
Ferrostatin-1	MCE	HY-100579
Fetal bovine serum	Gibco	10437010
Field emission scanning electron microscope	HITACHI	SU8010
Glutaraldehyde	Alfa Aesar	A10500.22
Lead nitrate	SANTA CRUZ	sc-211724
Osmium Tetroxide	SANTA CRUZ	sc-206008B
Panc02	European Collection of Authenticated Cell Cultures	98102213
Penicillin-streptomycin	Biosharp	BL505A
Phosphate Buffered Saline	Biosharp	BL302A
Pon 812 Epoxy resin	SPI CHEM	GS02660
Potassium ferrocyanide	Macklin	P816416
Thiocarbohydrazide	Merck	223220
Ultramicrotome	LEICA	EMUC7
Uranyl Acetate	RHAWN	R032929	2020.2