Rho1介导的肌动肌蛋白收缩力的光遗传学抑制与 果蝇 胚胎上皮张力的测量

摘要

肌动肌蛋白收缩力在细胞和组织形态发生中起重要作用。然而，在 体内 急性操纵肌动肌蛋白收缩力具有挑战性。该协议描述了一种光遗传学系统，该系统可快速抑制 果蝇 胚胎中Rho1介导的肌动肌蛋白收缩力，揭示了 体内肌动球蛋白失活后上皮张力的立即丧失。

摘要

肌动蛋白和非肌球蛋白II产生的收缩力（“肌动肌蛋白收缩力”）对于细胞和组织在多个长度尺度上的形态变化至关重要，例如细胞分裂，细胞迁移，上皮折叠和分支形态发生。深入了解肌动球蛋白收缩性在形态发生中的作用需要允许快速灭活肌动球蛋白的方法，这是使用传统的遗传学或药理学方法难以实现的。所提出的协议展示了使用基于CRY2-CIBN的光遗传学二聚化系统Opto-Rho1DN通过精确的时间和空间控制来抑制 果蝇 胚胎中的肌动球蛋白收缩力。在该系统中，CRY2融合到Rho1（Rho1DN）的主要负形式，而CIBN锚定在质膜上。蓝光介导的CRY2和CIBN二聚化导致Rho1DN从细胞质快速转移到质膜，在那里它通过抑制内源性Rho1使肌动球蛋白失活。此外，本文还提出了将Opto-Rho1DN介导的肌动球蛋白失活与激光消融偶联的详细方案，以研究肌动肌蛋白在 果蝇 腹侧沟形成过程中产生上皮张力中的作用。该协议可以应用于许多其他形态过程，这些过程涉及 果蝇 胚胎中的肌动肌收缩性，只需最少的修改。总体而言，这种光遗传学工具是剖析动态组织重塑过程中肌动肌蛋白收缩力在控制组织力学中的功能的有力方法。

引言

肌动蛋白收缩力是非肌肉肌球蛋白II（以下简称“肌球蛋白”）对F-肌动蛋白网络施加的收缩力，是改变细胞形状和驱动组织水平形态发生的最重要力量之一^1,2。例如，上皮细胞顶端结构域肌动蛋白收缩性的激活导致顶端收缩，这促进了各种形态发生过程，包括上皮折叠、细胞挤出、分层和伤口愈合 ^3,4,5,6,7.肌球蛋白的活化需要其调节轻链的磷酸化。这种修饰减轻了肌球蛋白分子的抑制构象，使它们能够形成两端具有多个头部结构域的双极肌球蛋白丝束。双极肌球蛋白丝驱动肌动蛋白丝的反平行运动并产生收缩力^1,8,9。

进化上保守的Rho家族小GTP酶RhoA（果蝇中的Rho1）在各种细胞环境中的肌动肌蛋白收缩力的激活中起核心作用^10....

研究方案

1.设置遗传杂交并准备卵子收集杯

1. 从光遗传系UASp-CIBNpm（I）中选择雌性苍蝇（处女）;UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry（III）在体视显微镜下的CO₂ 垫上，并与来自母体GAL4驱动线67 Sqh-mCherry的雄性苍蝇建立杂交;15 E-钙粘蛋白-GFP。
   注意：67和15代表插入第二（II）和第三（III）染色体的母体-微管蛋白-GAL4，分别为⁵²。该协议中使用的GAL4系还表达mCherry标记的肌球蛋白调节轻链Sqh（意大利面南瓜）³⁷ 和GFP标记的E-钙粘蛋白⁵³。来自光遗传系的苍蝇可能仍含有FM7和TM6平衡染色体。来自母体GAL4驱动系的苍蝇可能仍含有CyO和TM3平衡染色体。
2. ~10天后，选择具有以下基因型的F1雌性苍蝇：UASp-CIBNpm/+;67 平方/小时樱桃/+;15 E-钙粘蛋白-GFP/UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry。与雄性苍蝇一起设置一个鸡蛋收集杯。
   1. 确保具有正确基因型的雌性果蝇不包含任何平衡染色体（即，它们不应包含卷曲的翅膀[Cy]，短刚毛[Sb]，条形或肾形眼睛[B]或额外的肱骨刚毛[Hu]），这些染色体分别是用于产生....

讨论

该协议描述了光遗传学和激光消融的组合使用，以在肌动肌蛋白收缩性失活后立即探测组织张力的变化。这里描述的光遗传学工具利用Rho1（Rho1DN）的主要阴性形式来急性抑制内源性Rho1和Rho1依赖性肌动肌素收缩力。先前在果蝇腹侧沟形成背景下对Opto-Rho1DN的表征表明，该工具通过同时肌球蛋白失活和肌动蛋白拆卸来介导顶端肌动肌蛋白收缩力的快速失活非常有效⁴¹。特别是.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm glass-bottom dish	MatTek	P35G-1.5-10-C	Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid	Falcon	351007	Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope	Online	NA	Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite)	VWR	10028-048	Used for embryo dechorination
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114	Used for cross set-up
ddH2O	NA	NA	Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers	VWR	102091-654	Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2)	VWR	22940-834	Used for sample preparation
FluoView (Software)	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27	Sigma Aldrich	H8773-100ML	Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI	NIH	NA	Used for image analysis
MATLAB	MathWorks	NA	Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope	Nikon	NA	Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light.	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer)	VWR	30621-392	Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield)	Bolioptics	FM14036151	Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights	Amazon	NA	Used to avoid unwanted light stimulation