禽胚胎左心房结扎作为早期血管发育期间血流动力学负荷改变的模型

摘要

在这里，我们提出了一个详细的视觉方案，用于在禽类胚胎中执行左心房结扎（LAL）模型。LAL模型改变了心内血流，从而改变了壁剪切应力载荷，模仿左心发育不良综合征。提出了一种克服这种困难的显微手术模型挑战的方法。

摘要

由于其四腔成熟心室结构、易于培养、成像可达性和效率，禽胚胎是研究心血管发育的首选脊椎动物模型。旨在了解先天性心脏缺陷正常发育和预后的研究广泛采用该模型。引入显微手术技术来改变特定胚胎时间点的正常机械负荷模式，并跟踪下游分子和遗传级联。最常见的机械干预是左卵黄静脉结扎术、头丛束带术和左心房结扎术 （LAL），通过血流调节壁内血管压和壁剪切应力。鲎试剂，特别是 卵产中进行的鲎试剂，是最具挑战性的干预措施，由于极其精细的连续显微外科手术，样本产量非常小。尽管风险很高，但 卵 巢鲎试剂在科学上非常有价值，因为它模仿左心发育不良综合征 （HLHS） 的发病机制。HLHS 是一种在人类新生儿中观察到的临床相关的复杂先天性心脏病。本文记录了 卵内 LAL的详细方案。简而言之，受精的禽胚胎通常在37.5°C和60%恒定湿度下孵育，直到它们达到汉堡-汉密尔顿（HH）阶段20至21。将蛋壳裂开，去除外膜和内膜。轻轻旋转胚胎以露出心房的左心房球。将 10-0 尼龙缝合线的预组装微结轻轻定位并系在左心耳芽周围。最后，胚胎回到原来的位置，LAL完成。正常心室和鲎试剂器械化心室在组织压实方面表现出统计学上的显着差异。高效的LAL模型生成管道将有助于研究心血管成分胚胎发育过程中的同步机械和遗传操作。同样，该模型将为组织培养研究和血管生物学提供扰动的细胞源。

引言

先天性心脏缺陷 （CHD） 是由于胚胎发育异常而发生的结构性疾病¹.除遗传条件外，发病机制还受到机械负荷改变的影响^2,3。左心发育不良综合征 （HLHS） 是一种先天性心脏病，导致出生时心室/主动脉发育不全⁴ 死亡率高 ^5,6。尽管HLHS的临床管理取得了最新进展，但HLHS的血管生长和发育动态^仍不清楚7。在正常胚胎发育中，随着早期胚胎心管形成的进展，左心室 （LV） 心内膜和心肌起源于心脏祖细胞。据报道，心肌小梁逐渐形成、增厚层和心肌细胞增生².对于 HLHS，观察到小梁重塑改变和左心室扁平化，进一步导致心肌细胞异常迁移导致心肌发育不全 2,8,9,10

在广泛用于研究心脏发育和了解血流动力学状况的....

研究方案

受精的白色 Leghorn 卵是从值得信赖的供应商处获得的，并根据大学批准的指南进行孵化。雏鸡胚胎，第 18 阶段（第 3 天）至 24 阶段（第 4 天）（本文介绍的阶段）不被视为欧盟 （EU） 指令 2010/63/EU 和美国机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 指南的活脊椎动物。根据美国法律，雏鸡胚胎在孵化第 19 天后被视为“活体动物”，但不适用于欧盟。每个鸡蛋都标有孵化开始日期，并计划在孵化的^第 10 天之前孵化。种蛋孵化后，将雏鸡从孵化器中取出。该协议在两个台式操作站（工作站 1 和工作站 2）中执行，专注于专门的模型生成阶段。

1.显微手术前的准备

1. 从具有特定无病原体 （SPF） 等级的疫苗开发中心或通过值得信赖的商业供应商农场获得受精卵，由易碎的快递员装在干燥的聚苯乙烯容器中。孵化前，用浸泡在 70% 乙醇中的无绒湿巾轻轻清洁蛋壳以去除污染物。
2. 胚胎纳入/排除标准
   1. 不要孵化在运输过程中破裂或损坏的鸡蛋。
   2. 如果在LAL过程中或重新孵育后发现出血，请勿使用胚胎。
   3. 不要使用以左侧朝上位置发育的胚胎，因为血流动力学血流可能与正常方向不同。
   4. Dıscard胚胎在术前和术后手术中都存在先天性缺陷。
   5. 包括达到在其原始位置发育的目标阶段的胚胎，模仿HLHS作为LAL模型。

讨论

在 HLHS 中，由于结构缺陷导致血流改变，导致左侧形态异常 ^4,6。本模型提供了一个实用的实验系统，以更好地了解HLHS的进展，甚至可以模拟其发病机制⁸。然而，建立一个完全临床等效的HLHS动物模型是一项具有挑战性的任务。除了本文介绍的禽鲎模型外，最近对小鼠、胎羊和青蛙的研究还试图复制HLHS预后的形态学、血流动力学和病理.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 nylon surgical suture	Ethicon
Elastica van Gieson staining kit	Sigma-Aldrich	115974	For staining connective tissues in histological sections
Ethanol absolute	Interlab	64-17-5	For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water.
Incubator	KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A	AZYSS600-110
Kimwipes	Interlab	080.65.002
Microscissors	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	555640S	Vannas STR 82 mm
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	Sealing stage for egg reincubation
Paraplast Bulk	Leica Biosystems	39602012	Tissue embedding medium
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 508	Stemi 508	Used at station 1
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 2000-C	Stemi 2000-C	Used at station 2
Tweezer (Dumont 4 INOX #F4)	Adumont & Fils, Switzerland		Used to return the embryo
Tweezer (Super Fine Dumont #5SF)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	501985	Used to remove the membranes on the embryo