全安装荧光 原 位杂交研究 按 蚊精子发生

摘要

鉴于其简单的解剖结构， 按蚊 睾丸为研究精子发生提供了良好的细胞学模型。该方案描述了全安装荧光 原位 杂交，一种用于研究该生物过程的技术，以及携带参与精子生产的基因突变的转基因菌株的表型。

摘要

精子发生是一个复杂的生物过程，在此过程中，二倍体细胞经历连续的有丝分裂和减数分裂，然后发生巨大的结构变化以形成单倍体精子。除了生物学方面，研究精子发生对于理解和开发基因驱动和合成性别比扭曲器等遗传技术至关重要，通过分别改变孟德尔遗传和精子性别比，可用于控制害虫种群。这些技术已被证明在实验室环境中非常有前途，并有可能用于控制按蚊的野生种群， 按蚊 是疟疾的媒介。 由于睾丸解剖结构的简单性和医学重要性， 冈比亚按蚊是撒哈拉以南非洲的主要疟疾病媒，是研究精子发生的良好细胞学模型。该协议描述了如何使用全安装荧光 原位 杂交（WFISH）来研究细胞核结构的显着变化，使用特异性染色X和Y染色体的荧光探针的精子发生。FISH通常需要破坏生殖器官以暴露有丝分裂或减数分裂染色体，并允许用荧光探针对特定的基因组区域进行染色。WFISH能够保留睾丸的天然细胞学结构，同时通过靶向重复DNA序列的荧光探针进行良好的信号检测。这使研究人员能够沿着器官结构跟踪经历减数分裂的细胞的染色体行为的变化，其中可以清楚地区分该过程的每个阶段。该技术对于研究染色体减数分裂配对和研究与合成性别比例扭曲、杂交雄性不育和参与精子发生的基因敲除相关的细胞学表型特别有用。

引言

疟疾给全球人口的健康和福祉带来了巨大负担。2021 年，世界卫生组织 （WHO） 估计疟疾造成 619,000 人死亡，其中 96% 发生在撒哈拉以南非洲¹。该病由按蚊属的蚊子传播，在撒哈拉以南非洲，三个物种，即冈比亚按蚊（An. gambiae）、按蚊（An， coluzzi）和阿拉伯按蚊 （An. Arabiensis）在疟疾传播中起着不成比例的巨大作用，占全球疟疾病例的95%。依靠杀虫剂和抗疟药物等传统方法的控制计划挽救了数百万人的生命;然而，近年来，对这些控制方法的抵制不断增加，对其疗效提出了挑战^1,2。此外，COVID-19大流行施加的限制影响了关键疟疾控制干预措施的可用性，根据世卫组织《2022年世界疟疾报告》，这增加了疟疾发病率¹。在过去的二十年中，在实验室环境中开发了针对按蚊3,4,5,6,7,8,9,10的新型遗传控制方法。在这些策略中，基于基因驱动系统（GDS）和合成性别比扭曲器（SDs）的策略似乎很有前途。GDS依赖于以非常高的频率传播影响雌性生育能力或损害蚊子寄生虫生命周期的基因修饰的可能性^5,11,12。相反，SD 通过使蚊子后代的性别比例偏向雄性来发挥作用，随着时间的推移，由于缺乏雌性，这导致目标种群崩溃 ^4,6,13。这些遗传系统的主要组成部分主要作用于蚊子的生殖器官，配子、卵子和精子是在减数分裂^{后产生的 14}.

在该协议中，细胞遗传学技术的进步用于探索冈比亚安蚊中的精子发生，重点是染色体的原位行为。 蚊子睾丸的结构及其内部发生的生物学过程之前已使用多种细胞学方法进行研究，例如免疫荧光、荧光报告基因转基因以及 DNA 和 RNA 荧光原位杂交 （FISH）15,16,17,18,19,20;器官呈纺锤形，其中下极连接到连接到男性附属腺体的顺应导管上。在上极，生殖干细胞生态位增殖并分化为嵌入由体细胞形成的精囊内的精原细胞。经过多轮有丝分裂后，精原细胞分化为精母细胞，进入减数分裂。在前期，常染色体和性染色体与其同源物配对，并发生交叉。减数分裂后，产生圆形单倍体精子细胞并进入精子发生，这一过程导致成熟单倍体精子的形成，其中细胞质已被去除，核染色质凝聚，鞭毛出现在细胞核的基部^21,22（图1和图2）。

一般来说，精子发生大约在蛹中期开始，在蛹后期可以在精子库中检测到成熟的精子²³。精囊的成熟过程在成年后继续进行^23,24,25。在按蚊睾丸中，通过观察每个精囊中细胞的核形态，可以很容易地识别精子发生的每个步骤（图2）。本协议中描述的全安装荧光原位杂交（WFISH）允许研究人员特异性标记染色体区域并在精子发生过程中对其进行跟踪，同时保留器官的天然结构和细胞核位置;与标准DNA FISH方案相比，这代表了一个优势，在该方案中，器官通常被压扁，导致组织损伤¹⁹。在目前的方案中，荧光探针用于染色性染色体上的重复序列，从而跟踪它们在精子发生过程中的行为，从二倍体分裂细胞到成熟的单倍体精子。WFISH对于研究性染色体减数分裂配对和研究与合成性别比扭曲、杂交雄性不育和参与精子发生的基因敲除相关的细胞学表型特别有用4,19,26,27。

鉴于按蚊作为疟疾病媒的作用，它们成为越来越多的遗传病媒控制策略的目标，这些策略通常作用于这些生物体的生殖器官。已经产生了几种蚊子突变体和细胞学表型，需要研究新的细胞学技术26,27,28,29。本研究中描述的方法阐明了对精子发生的理解，以及有可能控制疟疾传播蚊子的遗传策略背后的细胞学机制。

研究方案

1. DNA探针标记

注：以下是生成荧光DNA探针的技术步骤，这些探针专门标记 冈比亚蚊 子的性染色体。

1. 使用PCR进行探针标记
   1. 使用市售的基因组DNA提取试剂盒从蛹或成年雄性中提取基因组DNA，以标记X或Y染色体（参见 材料表）。
   2. 制备PCR反应混合物：200ng基因组DNA，0.05mM未标记核苷酸（dATP，dCTP，dGTP），0.015mMdTTP和1uL荧光标记dUTP（Cy3，Cy5或其他荧光染料），50pmol正向和反向引物（表1），5μL10x PCR缓冲液和10U Taq DNA聚合酶（参见 材料表）。
   3. 为了标记18S rDNA和卫星AgY53B（表1），使用以下PCR参数进行PCR反应：一个95°C循环10分钟;95 °C 30 s、52 °C 30 s、72 °C 45 s 的 35 次循环;一个72°C循环5分钟;并在4°C下最终保持。
      注：为了使用PCR标记方法获得良好的探针浓度（~1μg，5μL中），这对于WFISH的成功至关重要，PCR反应应该是高效的。因此，在标记探针之前，强烈建议测试选择用于扩增的引物的功效。此外，在PCR反应中加入阳性对照（不含荧光dUTP）将有助于验证标记反应的功效。
   4. 将探头在-20°C的黑暗处存放。
2. 获得 3' 末端荧光寡核苷酸探针
   1. 通过将Cy3或Cy5荧光染料（或任何其他荧光染料）添加到核苷酸序列的3'端，获得作为修饰寡核苷酸的市售荧光寡核苷酸探针（参见 材料表）。参见 表1 中的引物/寡核苷酸，了解用于标记Y连接卫星AgY477-AgY53B连接区域和来自Contig_240的X连接卫星的参考序列。
      注意：没有与 3' 末端标记寡核苷酸浓度相关的技术障碍，因为用户通常可以在购买前选择。我们建议在杂交缓冲液中稀释~800 ng寡核苷酸探针溶液，以便使用寡核苷酸探针进行高效标记。Liang 和 Sharakhov¹⁹ 先前已将 X 和 Y 特异性寡核苷酸探针用于 WFISH，参考序列见 表 1。

2.杂交溶液的制备

注意：步骤1中生成的荧光探针必须掺入与目标序列杂交的化学溶液中。

1. 荧光 原位 杂交前的探针沉淀
   1. 向 1.5 mL 试管中加入 5 μL 标记的 DNA 探针（如果通过 PCR 标记方法获得）或 2.2 μL 来自步骤 1 的 3' 修饰寡核苷酸探针（~800 ng 探针）和 5 μL 鲑鱼精子 DNA（参见 材料表）。将特异性探针组合在同一管中，并将它们用作以下步骤中的独特解决方案。
   2. 通过加入0.1体积的3M乙酸钠和2体积的100%乙醇沉淀DNA探针。在-20°C下保持至少2.5小时（在-20°C下增加孵育时间将增加最终产量）。在这个阶段，探针也可以在离心前存放过夜。
   3. 在4°C下以17,000× g 离心20分钟，除去乙醇，并在室温下在黑暗中风干沉淀~20分钟。
2. 杂交解决方案
   1. 在进行睾丸解剖（步骤3）之前，通过在1.5管中混合以下试剂来制备杂交缓冲液：500μL甲酰胺，0.2g硫酸葡聚糖，100μL20x盐水柠檬酸钠（SSC）和200μL无菌H₂0（参见 材料表）。涡旋杂交溶液1分钟，并使硫酸葡聚糖在37°C下溶解30分钟。
   2. 将步骤2.1.3中的沉淀溶解在20-30μL杂交缓冲液中（涡旋约1分钟，快速旋转，并将试管在37°C下在黑暗中储存）以获得杂交溶液。

3.睾丸解剖和固定

1. 在室温（RT）下，在无菌1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中解剖来自蛹或1日龄成人的^至少 ~20个睾丸，并将它们转移到含有新鲜滴1x PBS溶液的干净显微镜载玻片上。
2. 使用P1,000宽孔过滤尖端或解剖针的尖端从1x PBS滴转移到含有3.7%甲醛的1x PBS和0.1%吐温-20（PBST）的胚胎培养皿中，并在室温下孵育10分钟。
3. 在室温下在1x PBST中洗涤睾丸5分钟，将睾丸在0.1mg / mL RNAse A（参见 材料表）中孵育，在无菌1x PBS中稀释，在37°C下孵育30分钟。
4. 取出RNAse溶液，加入渗透溶液（1%Triton / 0.1M HCl在1x PBST中），并在室温下孵育10分钟。
   注：蛋白酶K可用作10μg/ mL的渗透剂，在1x PBST中终浓度为10μg/ mL，以增加睾丸的通透性。
5. 在室温下在1x PBST中洗涤睾丸两次，每次5分钟。

4. 杂交

注意：本节介绍 原位 杂交的最后步骤。

1. 洗涤步骤（步骤3.5）后，将睾丸转移到1.5mL管中，其中含有含有先前制备的探针的20-30μL杂交溶液（步骤2.2.2）。使用移液器的尖端轻轻混合溶液。轻轻轻弹试管五次，然后继续下一步。
2. 在75°C下孵育5分钟用于DNA变性。
3. 在37°C下孵育过夜（如果可能，以低于100rpm摇摆）进行DNA-DNA杂交。
4. 使用P1,000宽孔过滤尖端将睾丸转移回胚胎培养皿中，并在预热至50°C的2x SSC中洗涤5分钟。
   注意：在杂交步骤之后，需要使用2x SSC进行最后的洗涤步骤;这在去除由器官组织内存在未杂交探针引起的任何背景信号方面起着重要作用。如果存在强背景信号，建议重复最后的洗涤步骤。
5. 取出2x SSC，并使用含有4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（参见 材料表）的市售封固剂将睾丸安装在磨砂载玻片上，用盖玻片密封剂密封，并在室温下在黑暗中孵育至少2小时。
6. 进行共聚焦成像。整个睾丸可以使用40倍或63倍油浸物镜进行可视化。如果执行 z 堆栈，我们建议使用 1.25 μm 的 z 步长。

讨论

通常，FISH方案要求挤压感兴趣的器官以允许染色体染色。这导致有关该器官内细胞空间排列的信息丢失³³。该协议描述了如何在原位研究生物过程，例如精子发生，同时保持睾丸的完整天然结构及其内部细胞学组织。靶向不同DNA重复元件的探针，特别是在性染色体²⁰中富集，可以同时用于揭示精子成熟的动力学。根据睾丸解剖的时间，WFISH提供了通过蚊子发育研究精子发生的不同阶段的机会。WFISH可用于研究特定现象，例如杂交不相容性，在按蚊中，这是由于减数分裂缺陷的存在，例如减数分裂前期失败和性染色体不分离19,34,35。除了生物学方面，精子发生是许多遗传策略的目标，这些策略是为了控制按蚊等害虫而开发的。在这种情况下，冈比亚 An. gambiae 的 X 连锁 rDNA 位点已被用作开发合成性别比例扭曲器的靶标，该扭曲器通过破坏携带 X 的精子，使后代偏向雄性 ^4,8,13。

该技术反映了在包括蚊子在内的几个分类群中发现的自然性别比减数分裂驱动的作用，但仍然知之甚少 28,36,37,38,39,40,41。WFISH提供了研究这种现象的机会，并为改进或改进基于性别扭曲的遗传策略铺平了道路，例如，通过提供有关精子产生的细胞学如何受到用于性染色体切碎的目标位点的选择的影响的信息。尽管根据我们的经验，WFISH显示出很高的成功机会，但失败仍然可能发生。这可能是由于组织通透水平低下，这可以通过增加渗透溶液的孵育时间来克服。或者，蛋白酶K可以在透化步骤中使用。在某些情况下，我们注意到探针穿透水平不均匀，精母细胞核中的信号较高，而减数分裂和精子发生阶段的信号较低或不存在。这可能是由于透化水平因细胞阶段而异。此外，当使用荧光探针设计用于靶向高拷贝数的DNA序列时，WFISH被证明是有价值的。当靶向单拷贝基因时，信号检测可能不够。在这种情况下，信号放大方法，例如酪胺信号放大（TSA），必须集成⁴²。

该方案可以与免疫染色或携带种系特异性荧光标记物^16,18的转基因报告菌株偶联^，因为这将增加有关蛋白质定位和原位基因表达的信息。在这项工作中，WFISH被描述为一种研究按蚊精子发生的技术;然而，鉴于雄性生殖器官的共同解剖结构，该协议可以应用于在疾病传播中发挥作用的其他蚊子物种。同样，可以使用这种技术研究雌配子发生。此外，可以探索感兴趣的器官或组织的细胞学研究，例如蚊子中肠，这是寄生虫入侵的靶标，或非典型遗传背景，例如杂交蚊子中的遗传背景，可以探索⁴³。此外，这种技术有可能转移到双翅目中的其他生物。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amersham CyDye Fluorescent Nucleotides, Cy3-dUTP	Cytiva	PA53022
Amersham CyDye Fluorescent Nucleotides, Cy5-dUTP	Cytiva	PA55022
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips	ThermoFisher Scientific	2079GPK
CytoBond Removable Coverslip Sealant	SciGene	2020-00-1
Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp.	Sigma-Aldrich	D8906-5G
DNeasy Blood & Tissue Kits	Qiagen	69504
Embryo Dishes	VWR	70543-30
Ethanol, molecular grade	Sigma-Aldrich	51976
Formamide	ThermoFisher Scientific	17899
GoTaq G2 DNA Polymerase	Promega	M7841
Hydrochloric acid, 37%	Sigma-Aldrich	320331
Microscope slides, SuperFrost	VWR	631-0114
PBS (10x), pH 7.4	ThermoFisher Scientific	70011044
Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	ThermoFisher Scientific	28906
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	ThermoFisher Scientific	P36941
RNase A/T1 Mix	ThermoFisher Scientific	EN0551
Set of dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Promega	U1330
Sodium Acetate Solution	ThermoFisher Scientific	R1181
SP8 inverted confocal microscope	Leica
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P1379
UltraPure Salmon Sperm DNA Solution	ThermoFisher Scientific	15632011
UltraPure SSC 20x	ThermoFisher Scientific	15557044
Primer sequences
5’-CAATAAATTTCCTTTTTAATGATGC AAAATCTACGTCTCTAGC-3’-[Fluorochrome]	Eurofins Genomics	Contig_240 (X)
5’AGAAGAATAGAATCAGAATAGT CGG TTTCTTCATCCTGAAAGCC-3’-[Fluorochrome]	Eurofins Genomics	AgY53B (Y)
5’-TTCTAAGTTTCTAGGCTTTAAGGA T GAAGAAACCGACTATTC-3’-[Fluorochrome]	Eurofins Genomics	AgY477- AgY53B junction region (Y)
F: AACTGTGGAAAAGCCAGAGC R: TCCACTTGATCCTTGCAAAA	Eurofins Genomics	18S rDNA (X)
F: CCTTTAAACACATGCTCAAATT R: GTTTCTTCATCCTTAAAGCCTAG	Eurofins Genomics	AgY53B (Y)