根癌农杆菌介导的绿色微藻、寻常小球藻的基因工程

摘要

该方案概述了 利用根癌农杆菌介导的转化（AMT）将目的基因整合到绿色微藻 小球藻的核基因组中，从而产生稳定的转化体。

摘要

根癌农杆菌介导的转化（AMT）是一种广泛使用的植物基因组操纵工具。然而， 根癌曲霉 表现出将基因转移到多种物种的能力。许多微藻物种缺乏将目标基因可靠地整合到其核基因组中的成熟方法。为了利用微藻生物技术的潜在优势，简单高效的基因组操作工具至关重要。本文，利用报告绿色荧光蛋白（mGFP5）和潮霉素B的抗生素耐药性标记物，提出了针对工业微藻物种 寻常小球藻的优化AMT方案。经过十代以上的传代培养后， 通过荧光定量 mGFP5 的表达，表明 T-DNA 盒的稳定转化。该方案允许在两周内可靠地生成多个转基因 寻常念珠 菌菌落，采用市售的pCAMBIA1302植物表达载体。

引言

根癌农杆菌是一种革兰氏阴性土壤传播细菌，具有独特的界间基因转移能力，因此被誉为“天然基因工程师”¹。这种细菌可以通过 IV 型分泌系统将 DNA （T-DNA） 从肿瘤诱导质粒 （Ti-Plasmid） 转移到宿主细胞中，导致 T-DNA 在宿主基因组内的整合和表达 1,2,3,4。在自然环境中，这个过程会导致植物肿瘤形成，通常称为冠瘿病。然而，农杆菌也可以将 T-DNA 转移到各种其他生物体中，包括酵母、真菌、藻类、海胆胚胎，甚至在实验室条件下的人类细胞 5,6,7,8。

利用这一自然系统， 根癌农杆菌介导的转化 （AMT） 通过修饰 Ti 质粒的 T-DNA 区域，将目标基因随机整合到宿主细胞的核基因组中。为此，广泛使用的AMT植物表达载体是pCAMBIA1302⁹。研究人员可以在 大肠杆 菌中采用简单的克隆工作流程，然后将所需载体转移到 根癌不杆菌 中，以便随后转移到目标宿主中。

绿色微藻是真核生物，与陆地植物有许多相似之处，但对基因改造非常顽固。然而，遗传转化在微藻的基础和生物技术研究中都起着至关重要的作用。在几种微藻物种中，特别是莱茵衣藻，通过 AMT 的遗传转化已成功引入转基因，例如人白细胞介素 2 （hIL-2）、严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 受体结合域 （SARS-CoV-2 RBD） 和两种抗菌肽 （AMP）¹⁰、¹¹、^12、13。其中，小球藻是一种不那么挑剔和快速生长的绿藻物种，在碳水化合物、蛋白质、营养保健品、色素和其他高价值化合物的可持续生产方面具有巨大的潜力¹⁴。然而，缺乏可靠的工具来创造转基因的寻常梭菌菌株阻碍了其商业进展。由于在 C. vulgaris¹⁵ 中使用 AMT 的已发表作品数量有限，并且鉴于植物和微藻培养之间存在相当大的差异，因此优化 AMT 协议变得至关重要。

在这项研究中，研究人员在花椰菜花叶病毒（CamV）35S启动子的下游插入绿色荧光蛋白（mGFP5），并添加了组氨酸标签，将其用作蛋白质表达的报告基因。使用潮霉素B选择转化体，经过20代以上的传代培养，转化保持稳定。本研究中使用的pCAMBIA1302质粒可以很容易地适应任何目的基因。此外，所提供的方法和材料可以针对具有活性 CamV35S 启动子的其他绿藻物种进行调整，因为该启动子用于潮霉素选择。

研究方案

除非另有说明，否则所有培养基和溶液必须在使用前进行高压灭菌。所有离心管、移液器吸头等在使用前应无菌或高压灭菌。为了便于参考， 表1中列出了该协议中使用的培养基配方。

1. 根癌曲霉电 感受态细胞的制备

1. 将农杆菌（AGL-1）接种到25mL无菌摇瓶中，该瓶装有LB培养基（补充利福平，20mg / L - 1），来自冷冻甘油原液，并在28-30°C和150rpm下生长过夜。
   注： 农杆菌 菌株AGL-1对利福平、氨苄西林、氯霉素和链霉素具有抗性（见 材料表），可从多家供应商处获得。
2. 第二天，通过将0.5μL过夜培养物加入50mL高压灭菌的超纯水中，将培养物稀释1,00,000倍，并将10μL稀释的培养物铺在LB板上，然后在28-30°C下孵育1-3天。
3. 选择一个菌落，并在28-30°C下用利福平在LB中开始20mL过夜培养。
4. 第二天，在装有9 mL过夜培养物的摇瓶中接种500 mL LB培养基（无抗生素），并在28-30°C下生长，直到OD₆₀₀ 达到0.5。
5. 将培养物均匀地分成10个50mL离心管，并在冰上冷却30分钟。将离心机预冷至4°C。
6. 将试管在4°C和4000× g 离心15分钟。随后，使用移液管除去尽可能多的上清液，并将每个试管中的沉淀重悬于 50 mL 冰冷水中。
7. 将细胞在4°C和4000× g 离心15分钟。除去上清液，将沉淀重悬于每个试管中 25 mL 冰冷的水中。
8. 将细胞在4°C和4000× g 离心15分钟。除去上清液，将沉淀重悬于每个试管中 1 mL 冰冷的 10% （w/v） 甘油中。
9. 将所有试管合并到一个50mL试管中，并将细胞在4°C和4000× g 下离心15分钟。除去上清液，将沉淀重悬于400μL冰冷的10%（w / v）甘油中。细胞浓度应约为 1-3 x^{10 10} 个细胞/mL。
10. 将细胞以 50 μL 等分试样的形式分布在无菌预冷微管中。在液氮中冷冻并储存在-80°C冰箱中。

2. 根癌不动杆菌的电穿孔

1. 将 50 μL AGL-1 根癌曲霉 电感受态细胞加入预冷的 0.1 mm 比色皿中，并加入 2 μL pCAMBIA1302 或类似质粒 （浓度 15 ng/μL）（参见 材料表）。
2. 使用电穿孔仪在 2400 V 下电穿孔（200 Ω，电容扩展器 250 μFD，电容 25 μFD，指数衰减，参见 材料表）。时间常数应为 >4.5 ms，才能成功进行指数衰减电穿孔。
3. 立即向比色皿中加入 1 mL LB 培养基，轻轻上下移液以混合。将1mL重悬细胞转移到1.5mL微管中，并在28-30°C下孵育至少1小时以恢复。
4. 将细胞铺在含有适当抗生素的LB琼脂上（即，50mg / L卡那霉素用于pCAMBIA1302的原核选择）。
5. 在28-30°C孵育2-3天。
6. 选择一个菌落，用适当的选择（50mg / L卡那霉素用于pCAMBIA1302）在LB中生长过夜，并在-80°C下使用50%甘油冷冻保存含质粒的菌株以备将来使用。

3. 寻常梭菌的AMT

注：同时制备寻常念珠菌（UTEX 395，见材料表）和根癌农杆菌培养物进行共培养。寻常隐杆菌的培养应在制备根癌隐杆菌培养物前 3 天开始。根据 Kumar 等人发表的协议进行了^修改7。

1. 准备寻常梭菌培养物
   1. 寻常梭菌 传统上储存在斜面上或在光照条件下保持在对数期培养物中。从OD₆₀₀ = 1.0的对数期培养物开始，将0.5mL扩散到Tris-乙酸盐 - 磷酸盐（TAP，参见表1）琼脂平板（ 1.2%w / v琼脂A）上，并在25°C下在光照下生长5天（50μE/ m²秒）。这将产生大约 5 x 10⁶ 个细胞。
2. 准备根癌不动杆菌培养物
   1. 通过使用甘油储备液接种补充有 15 mM 葡萄糖、20 mg/L 利福平和 50 mg/L 卡那霉素的 10 mL LB 培养基，在摇床中培养 根癌曲 霉菌 AGL-1 pCAMBIA1302 菌株（参见 材料表）。在28-30°C和250rpm下孵育过夜。
   2. 将 1 mL 过夜培养物接种到 50 mL LB 中，加入 15 mM 葡萄糖、20 mg/L 利福平和 50 mg/L 卡那霉素，并在 28-30 °C 和 250 rpm 下孵育直至 OD₆₀₀ 达到 1.0。
3. 共培养寻常念珠菌和根癌曲霉
   1. 为了准备用于共培养的 根癌不动杆菌 培养物，将生长的培养物转移到 50 mL 管中，并在室温下以 4000 x g 离心 30 分钟。使用移液管除去上清液，并用诱导培养基洗涤细胞两次。
      注：使用的诱导培养基是调节至pH 5.5的TAP培养基，并补充有F/2培养基痕量金属和含有200μM乙酰丁香酮的维生素（AS，参见 材料表）。将细胞重悬于诱导培养基中，使OD₆₀₀ = 0.5。
   2. 为了制备用于共培养的寻常念珠菌培养物，将 25 mL 诱导培养基加入到含有 ~ 5 x 10⁶ 个细胞的寻常梭菌平板中。转移到 50 mL 试管中。在室温下以4000×g离心细胞15分钟，弃去上清液。
   3. 将藻类细胞沉淀物与200μL细菌悬浮液（OD₆₀₀：0.5）混合，并在21-25°C，150rpm的旋转振荡器中孵育1小时。
   4. 将混合培养物（200μL）铺展到补充有15mM葡萄糖的诱导培养基板上，并在21-25°C下在黑暗中孵育3天。
   5. 3天后，使用补充有400mg / L头孢噻肟或20mg / L四环素（参见材料表）的10mLTAP培养基收集微藻，并在21-25°C的黑暗中孵育2天，以消除培养物中的根癌杆菌。
   6. 将 500 μL 培养物铺在选择性培养基上，例如，补充有 20-70 mg/L 潮霉素 B（使用 pCAMBIA1302 时）和 400 mg/^L-1 头孢噻肟或 20 mg/L 四环素的 TAP 培养基。在黑暗中孵育21-25°C2天，然后将它们放入照明室中。
      注意：耐药菌落将在光照后 5-7 天出现。
   7. 从转化平板中挑选单个菌落，并在补充有400mg / L头孢噻肟或20mg / L四环素和20-70mg / L潮霉素B的TAP琼脂平板上重新划线。

4. 菌落PCR（cPCR）确认 寻常梭菌 转化体中的基因整合

1. 使用植物基因组 DNA 提取试剂盒从单个菌落中传代培养至少两次后，从寻常梭菌转化体中提取基因组 DNA（参见材料表）。以此为PCR模板，设计T-DNA的mgfp5区域引物（mgfp5-Fwd：5'CCCATCTCATAAATAACGTC 3'和M13-Rev：5'CAGGAAACAGCTATGAC 3'）。
   1. 使用 Q5 高保真 DNA 聚合酶预混液试剂盒（参见 材料表），进行聚合酶链反应 （PCR） 以验证转基因整合。
      注：本研究使用以下条件：98°C3分钟;35 次循环（98 °C 持续 10 秒，57 °C 持续 30 秒，72 °C 持续 1 分钟）;72°C5分钟。使用 pCAMBIA1302 作为阳性对照，使用野生型 寻常念珠菌 基因组 DNA 作为阴性对照。
2. 为了确认样品中没有pCAMBIA1302，由于 根癌曲霉的残留污染，使用菌落PCR。将少量转化细胞加入10μL无菌水中，并在98°C下煮沸15分钟。将其用作 PCR 的模板。
   1. 在pCAMBIA1302（B1-Fwd：5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3'和B1-Rev：5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3'）上设计T-DNA以外的区域引物。
      注：本研究使用以下条件：94°C3分钟;30 次循环（94 °C 持续 30 秒，48 °C 持续 30 秒，68 °C 持续 5 分钟）;68°C7分钟使用煮沸的 根癌曲 霉AGL-1（pCAMBIA1302）菌落作为阳性对照，使用煮沸的 野生型寻常梭菌菌 落作为阴性对照。
3. 为确认样本中不存在 A. tumerfaciens 污染，请使用菌落 PCR。将少量转化细胞加入10μL无菌水中，并在98°C下煮沸15分钟。将其用作 PCR 的模板。
   1. 设计AGL-1毒力质粒（virE2-Fwd：5'AGGGAGCCCTACCCG 3'和virE2-Rev：5'GAACCAGCCTGGAGTTCG 3'）上所含virE2基因的引物。
      注：本研究使用以下条件：94°C3分钟;30 次循环（94 °C 持续 30 秒，53 °C 持续 30 秒，68 °C 持续 3 分钟）;68°C7分钟使用煮沸的 根癌曲 霉AGL-1（pCAMBIA1302）菌落作为阳性对照，使用煮沸的 野生型寻常梭菌菌 落作为阴性对照。
4. 在DNA琼脂糖凝胶和分子量标准（1 Kbp DNA分子量标准，参见 材料表）上运行PCR样品，以确认所得片段的大小¹⁶。

5. 测量转化体的荧光

1. 将来自对数期维持培养物或TAP琼脂斜的每种转化体接种到补充有200mg / L - 1头孢噻肟和25mg / L - 1潮霉素B的50mLTAP中，使起始OD₆₀₀ = ^0.1。用野生型寻常型C. várgaris和仅200mg / ^L-1头孢噻肟作为阴性对照接种一种培养物。在25°C下以150rpm与150μmol/ m²秒的光合有效光一起孵育（参见材料表）。
2. 每 24 小时，取 300 μL 样品，并在 96 孔板读数仪或紫外/可见光谱仪和荧光计中测量吸光度和荧光（激发 488 nm，发射 526 nm）（参见 材料表）。使用底部透明的黑色板进行同时测量。

6. 粗蛋白提取、蛋白纯化、SDS-PAGE电泳

1. 将转化体 （#50） 从对数期维持培养物接种到 300 mL 的 TAP 中，补充有 200 mg/L-1 头孢噻肟和 25 mg/^L-1 潮霉素 B，以达到 OD₆₈₀ = ^0.1。用野生型寻常型C. várgaris和仅200mg / ^L-1头孢噻肟作为阴性对照接种一种培养物。在25°C下以150rpm孵育150μmol/ m²秒的光合活性光。
2. 使用 5 mL 裂解缓冲液（见 表 1）从转化体 （#50） 和野生型菌株中提取粗蛋白样品，然后超声处理 4 分钟。
3. 用Ni-NTA树脂通过5 mL聚丙烯色谱柱纯化粗蛋白样品（参见 材料表）。
4. 冻干 15 mL 纯化的蛋白质样品，并将其重悬于 1 mL 裂解缓冲液中用于 SDS-PAGE 分析¹⁷。

结果

为了显示使用上述方法成功转化，将寻常梭菌与含有pCAMBIA1302质粒的AGL-1或不使用质粒（野生型并接种在补充有潮霉素B和头孢噻肟的TAP琼脂上）共培养（图1A）。最左边的板显示了能够在潮霉素 B/头孢噻肟平板上生长的转化菌落，中间板显示野生型 AGL-1 不能在潮霉素 B/头孢噻肟平板上生长。最右边的板显示，当不使用选择（仅头孢噻肟）时，寻常梭菌转化体和?...

讨论

转换效率与几个不同的参数相关联。用于AMT的 根癌不动杆菌菌 株的选择至关重要。AGL-1 是已发现的最具侵袭性的菌株之一，因此，已常规用于植物 AMT。 用葡萄糖 （15-20 mM） 补充诱导培养基对于 AMT 效率也很重要。考虑到 寻常梭菌 可以在光养和异养条件下生长，微藻培养基中通常省略葡萄糖或其他碳源以防止污染。例如，Bold 的基础培养基 （BBM） 是 C. vulgaris^19<...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 Kb Plus DNA ladder	FroggaBio	DM015
Acetosyringone	Fisher Scientific	D26665G
Agrobacterium tumefaciens	Gold Biotechnologies	Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas	Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
Biotin	Enzo Life Sciences	89151-400
CaCl2·2H2O	VWR	BDH9224-1KG
Cefotaxime	AK Scientific	J90010
Chlorella vulgaris	University of Texas at Austin Culture Collection of Algae	Strain: UTEX 395	Wildtype strain
CoCl2·6H2O	Sigma Aldrich	C8661-25G
CuSO4·5H2O	EMD Millipore	CX2185-1
FeCl3·6H2O	VWR	BDH9234-500G
Gene Pulser Xcell Electroporator	Bio-Rad	1652662	Main unit equipped with PC module.
GeneJET Plant Genome Purification Kit	Thermo Scientific	K0791
Glacial acetic acid	VWR	CABDH3093-2.2P
Glycerol	BioBasic	GB0232
HEPES Buffer	Sigma Aldrich	H-3375
Hygromycin B	Fisher Scientific	AAJ6068103
K2HPO4	VWR	BDH9266-500G
Kanamycin	Gold Biotechnologies	K-250-25
KH2PO4	VWR	BDH9268-500G
MgSO4·7H2O	VWR	97062-134
MnCl2·4H2O	JT Baker	BAKR2540-01
Na2CO3	VWR	BDH7971-1
Na2EDTA·2H2O	JT Baker	8993-01
Na2MoO4·2H2O	JT Baker	BAKR3764-01
NaCl	VWR	BDH7257-7
NaH2PO4 H2O	Millipore Sigma	CA80058-650
NaNO3	VWR	BDH4574-500G
NEBExpress Ni Resin	NewEngland BioLabs	NEB #S1427
NH4Cl	VWR	BDH9208-500G
pCAMBIA1302	Leiden University	Gift from Prof. Paul Hooykaas	pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)
Polypropylene Columns (5 mL)	QIAGEN	34964
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL	Bio-Rad	1610363
Rifampicin	Millipore Sigma	R3501-1G
SunBlaster LED Strip Light 48 Inch	SunBlaster	210000000906
Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer	BioTEK	S4MLFPTA
Tetracycline	Thermo Scientific Chemicals	CAAAJ61714-14
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12%	Bio-Rad	1610185
Thiamine	TCI America	T0181-100G
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500
Tryptone	BioBasic	TG217(G211)
Vitamin B12 (cyanocobalamin)	Enzo Life Sciences	89151-436
Yeast Extract	BioBasic	G0961
ZnSO4·7H2O	JT Baker	4382-01