在自由移动和头部固定的动物中使用微棱镜对已识别的神经种群进行长期成像

摘要

当与头板和与单光子和双光子显微镜兼容的光学设计集成时，微棱镜透镜在测量不同条件下垂直柱中的神经反应方面具有显着优势，包括头部固定状态下的良好控制实验或自由移动动物的自然行为任务。

摘要

随着多光子显微镜和分子技术的进步，荧光成像正在迅速发展成为研究活体脑组织结构、功能和可塑性的有力方法。与传统的电生理学相比，荧光显微镜可以捕获细胞的神经活动和形态，从而能够以单细胞或亚细胞分辨率长期记录已识别的神经元群。然而，高分辨率成像通常需要一个稳定的、头部固定的设置，以限制动物的运动，并且制备透明玻璃的平面允许在一个或多个水平面上可视化神经元，但在研究跨不同深度的垂直过程方面受到限制。在这里，我们描述了一种将头板固定和微棱镜相结合的程序，该微棱镜可提供多层和多模态成像。这种手术准备不仅可以进入小鼠视觉皮层的整个柱子，而且允许在头部固定位置进行双光子成像，在自由移动的范式中进行单光子成像。使用这种方法，人们可以对不同皮层中已识别的细胞群进行采样，在头部固定和自由移动状态下记录它们的反应，并跟踪几个月的长期变化。因此，该方法提供了对微电路的全面分析，能够直接比较由良好控制的刺激和自然行为范式引起的神经活动。

引言

体内双光子荧光成像^1,2的出现，结合了光学系统中的新技术和转基因荧光指示剂，已成为神经科学中研究活体大脑中复杂结构、功能和可塑性的强大技术^3,4.特别是，这种成像方式通过捕获神经元的形态和动态活动，提供了比传统电生理学无与伦比的优势，从而促进了对已识别神经元^{的长期跟踪5,6,7,8}。

尽管具有显著的优势，但高分辨率荧光成像的应用通常需要静态的头部固定设置，从而限制动物的活动能力^9,10,11。此外，使用透明玻璃表面可视化神经元将观察限制在一个或多个水平面上，限制了对跨越不同皮层深度的垂直过程动力学的探索¹²。

为....

研究方案

所有实验均根据 1986 年英国动物（科学程序）法案进行，并经英国内政部批准和颁发的个人和项目许可证，并经过适当的伦理审查。成虫转基因品系CaMKII-TTA;培育了GCaMP6S-TRE²¹ ，并将其后代用于实验。为了实验人员的安全和维持无菌条件，所有程序均在无菌条件下进行，并配备完整的个人防护设备。

1.术前准备

1. 为了尽量减少水肿，手术前12-24小时皮下注射地塞米松（0.2mg / kg）。
2. 在高压灭菌器中对所有手术工具进行灭菌，并在手术前用稳定的次氯酸和蒸馏水和 70% 乙醇对手术区域进行灭菌。确保所有手术设备都已打开。
3. 使用异氟醚麻醉动物（24周龄，雄性体重31g），诱导剂量为5%，一旦小鼠在立体定位框架上，该剂量降低至1%-2%，O₂ 保持在1-2L / min之间。皮下注射非甾体抗炎药（卡洛芬，2.5 mg/kg）。
4. 检查是否存在脚趾捏反射以评估麻醉深度（如果出现反射，则以 0.5% 的增量增加异氟烷浓度）。
5. 使用修剪器将动物的头部从耳朵后面剃到眼睛上方。用酒精湿巾和聚维酮碘溶液清洁该区域，确保避免接触动物的眼睛。
6. 将动物安装在装有耳杆和齿杆的恒温加热垫和立体定位框架上，并固定头部。确保头部稳定，因为这对于以下程序的成功至关重要（

讨论

在这里，我们已经展示了在同一神经群体中观察和直接比较头部固定和自由移动条件下神经元的能力。虽然我们演示了在视觉皮层中的应用，但该协议可以适应许多其他大脑区域，包括皮层区域和深核24,25,26,27,28，以及其他数据采集和行为设置^29,30

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml	Dechra	20091607	Saline for hydration and drug reconsitution
18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur	FST	18004-18	Drill bit
1ml syringe	Terumo	MDSS01SE	1ml syringe
23G x 5/8 inch 6% LUER needle	Terumo	NN-2316R	23G needle
71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software	RWD	-	RWD
Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm)	Surgispon	SSP-101010	gel-foam
Alcohol pads 70% isopropyl alcohol	Braun	9160612	Alcohol pads
Aluminium foil	Any retailer	-	Foil to cover eyes during surgery
Articifical Cerebrospinal Fluid	Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand	3525/25ML	ACSF
Automated microinjection pump	WPI	8091
Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml	Videne/Ecolab	3030440	Betadine
Bruker Ultime 2Pplus (customised)	Bruker	-	Two-photon imaging system
Cardiff Aldasorber	Vet-Tech	AN006	Anaesthesia absorber
CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC	Nikon	MRH48230	20x objective lens
Compact Anaesthesia system - single gas - isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit	Vet-Tech	AN001	Compact anaesthesia system
Contec Prochlor	Aston Pharma	AP2111L1	Disinfectant (hypochlorous acid)
Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25	Hikma	Covetrus:70789	Dexamethasone
Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel	Fine Science Tools	10055-12	Knife for incisino of cortex
Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars	Stoelting	51649	Ear bar
Dummy microscope	Inscopix	Dummy microscope	To help with implantation
Ethanol (100%)	VWR	40-1712-25	Used to make 70% ethanol
Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III	FischerScientific	17182182	Gloves
Homeothermic Monitor 50-7222-F	Harvard Apparatus	50-7222-F	Homeothermic monitoring system/heating pad
Image processing software	ImageJ	-	Image processing software
Inscopix Data Processing Software (IDPS)	Inscopix	-	One-photon calcium imaging processing software
Insight Duals-232, S/N 2043	InSight	Insight Spectra X3	Two-photon imaging laser
IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation	Zoetis	WM 42058/4195	Isoflurane
Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive	World Precision Intruments (WPI)	KWIK-SIL	Silicone adhesive
MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E	PROXXON	NO 28 515	Handheld drill
nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package	Inscopix	-	One-photon Imaging system and software
ProView Implant Kit	Inscopix	ProView Implant Kit	Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment
ProView Prism Probe	Inscopix	1050-002203	Microprism lens
Rimadyl (50mg/ml)	Zoetis	VM 42058/4123	Carprofen
Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp	WPI	PZMTIII-AAC	Microscope
Super-Bond Universal kit, SUN Medical	Prestige-Dental	K058E	Adhesive cement
Two-photon calcium image software	Suite2P	-	Two-photon calcium imaging processing software
Vapouriser	Vet-Tech	-	Isoflurane vapouriser
Xailin Lubricating Eye Ointment 5g	Xailin-Night	MLG/28/1551	Ophthalmic ointment