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本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 代表性结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

离子通道的药理学靶向是治疗实体瘤的一种有前途的方法。提供了详细的方案，用于表征癌细胞中的离子通道功能并分析离子通道调节剂对癌症活力的影响。

摘要

离子通道对于细胞发育和维持细胞稳态至关重要。离子通道功能的扰动有助于各种疾病或离子通道病的发展。癌细胞利用离子通道来驱动自身的发育，以及作为肿瘤的改善，并在包括各种非癌细胞的微环境中同化。此外，肿瘤微环境中生长因子和激素水平的增加可导致离子通道表达增强，从而有助于癌细胞增殖和存活。因此，离子通道的药理学靶向是治疗实体恶性肿瘤（包括原发性和转移性脑癌）的潜在有前途的方法。本文描述了表征癌细胞中离子通道功能的协议以及分析离子通道调节剂以确定其对癌症活力的影响的方法。这些包括对细胞进行离子通道染色，测试线粒体的极化状态，使用电生理学建立离子通道功能，以及进行活力测定以评估药物效力。

引言

膜转运蛋白对于细胞之间的通讯以及维持细胞稳态至关重要。在膜转运蛋白中，离子通道用于驱动细胞的生长和发育，并在具有挑战性和不断变化的环境中维持细胞的状态。据报道，离子通道还可以驱动和支持实体瘤的发展，包括全身和中枢神经系统（CNS）1,2。例如，KCa3.1通道负责调节膜电位和控制细胞体积，这在细胞周期调节中很重要。据报道，有缺陷的KCa3.1通道有助于肿瘤细胞的异常增殖3。此外，离子通道可能有助于癌症的转移性播散。例如，瞬时受体电位 （TRP） 通道参与 Ca 2+ 和 Mg2+ 内流;这种涌入激活了几种激酶和热休克蛋白，它们的作用是调节肿瘤周围的细胞外基质，这反过来又对启动癌症转移很重要4。

由于离子通道有助于癌症的发展，它们也可能是药物相关癌症治疗的靶标。例如，对治疗方式（包括化疗和新型免疫疗法）的耐药性与离子通道功能失调有关5,6,7。此外，离子通道正在成为阻碍癌症生长和发展的重要药物靶点，正在研究重新利用的小分子（FDA批准）药物....

研究方案

1. 培养细胞中的免疫标记离子通道

  1. 准备细胞和实验装置
    1. 将细胞维持在75cm2 培养瓶中作为活跃生长的培养物。传代一次细胞，直到它们变得50%-90%汇合，具体取决于所用细胞系的倍增时间。
      注意：对于本研究，使用了D283细胞，即第3组髓母细胞瘤细胞系。
    2. 将培养瓶中的细胞收集到离心管（15 mL或50 mL）中，并加入2 mL的0.25%胰蛋白酶-EDTA以分离贴壁细胞。在室温（RT）下孵育5分钟。5分钟后，轻敲烧瓶三到五次以帮助分离细胞。将细胞收集在含有10%FBS的10mL培养基中以停止胰蛋白酶的作用。
    3. 在室温下以480× g 离心5分钟。 轻轻吸出培养基。不要打扰细胞沉淀。
    4. 根据培养物的密度，将细胞重悬于 5 mL 至 10 mL 培养基中。
      注意：密度必须与活跃生长的细胞一致，并且取决于烧瓶中细胞的汇合度。应使用视觉评估来近似最佳细胞密度;具体来说，细胞应该在40%-90%之间汇合且均匀分布。
    5. 取出 100 μL 细胞，并加入含有 100 μL 0.4% 台盼蓝的 1.5 mL 管中，以标记非活细胞。根据细胞系在室温下孵育5-15分钟。
    6. 使用血细胞计数器（参见 材料表）在 10 μL 溶液中手动计数细胞。计数血细胞计数器16个正方形的四个角中每个角落的活的，未染色的细胞。将平均细胞数乘以稀释因子，....

代表性结果

以上是可用于表征癌细胞中离子通道的选择程序。第一个方案突出显示离子通道的染色。如前所述，在染色离子通道或就此而言，染色细胞外膜中存在的任何蛋白质时存在许多挑战。图1所示是五聚体GABAA受体亚基的染色。第二个协议强调了测试癌细胞中线粒体极化状态的结果。线粒体对细胞活力和增殖以及细胞死亡起着至关重要的作用。在哺乳动物细胞中，线粒体?.......

讨论

离子通道功能的变化会改变细胞内信号级联，从而影响细胞的整体功能。在过去的十年中，越来越清楚的是离子通道对癌细胞的生长和转移很重要。重要的是，许多离子通道是针对各种疾病的已获批疗法的主要靶标24。研究人员已经探索了离子通道是否可能是抗癌靶点，初步结果是有希望的2,16,25。该领域刚刚.......

披露声明

D.A.P.K. 是 Amlal Pharmaceuticals Inc. 的联合创始人、总裁兼首席执行官，S.S. 是 Amlal Pharmaceuticals Inc. 的联合创始人，也是 Bexion Pharmaceuticals， Inc. 的药物安全监测委员会成员。

致谢

作者感谢Thomas E. & Pamela M. Mischell Family Foundation对S.S.的支持，以及Harold C. Schott基金会对加州大学医学院Harold C. Schott捐赠主席的资助。

....

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
ABS SpectraMax Plate ReaderMolecular DevicesABS
AccutaseInvitrogen00-4555-56
Alexa Flor 488InvitrogenA32723Goat Anti-Rabbit
Antibiotic-AntimycoticGibco15240-062100x
B27 SupplementGibco12587-010Lacks vitamin A
Biosafety CabinetLABCONCO302381101Class II, Type A2
Bovine Serum AlbuminFisher ScientificBP1606-100
CO2 IncubatorFisher Scientific13-998-211Heracell VIOS 160i
Calcium ChlorideFisher ScientificC7902Dihydrate
Cell Culture Dishes, 150 mmFisher Scientific12-600-004Cell culture treated
Cell Culture Flasks, 75 cm2Fisher Scientific430641UCell culture treated
Cell Culture Plates, 6 wellFisher Scientific353046Cell culture treated
Cell Culture Plates, 96 wellFisher Scientific353072Cell culture treated
CentrifugeEppendorfEP-5804RRefrigerated
Corning CoolCellFisher Scientific07-210-0006
Coverslips, 22 x 22 mmFisher Scientific12-553-450Corning brand
D283 MedATCCHTB-185
DABCO Mounting MediaEMS17989-97
D-GlucoseSigma Life SciencesD9434
Dimethyl SulfoxideSigma AldrichD2650Cell culture grade
DMEM/F12, base mediaFisher Scientific11330-032With phenol red
DMEM/F12, phenol red freeFisher Scientific21041-025
EGTASigma AldrichE4378
Epidermal Growth FactorSTEMCELL78006.1
FCCPAbcamAB120081
Fetal Bovine Serum, QualifiedGibco10437-028
Fibroblast Growth Factor, BasicMilliporeGF003
GARBA5 AntibodyAvivaARP30687_P050Rabbit Polyclonal
GlutamaxGibco35050-061
Glycerol Mounting MediumEMS17989-60With DAPI+DABCO
HemocytometerMillipore Sigma
HeparinSTEMCELL7980
HEPESHyCloneSH3023701Solution
HEPESFisher ScientificBP310-500Solid
ImageJOpen platformWith Fiji plugins
Immuno Mount DAPIEMS17989-97
KRM-II-08experimental compounds not available from a commercial source
Leica Application Suite XLeica Microsystems
Leukemia Inhibitory FactorNovusN276314100U
L-GlutamineGibco25030-081
Magnesium ChlorideSigma AldrichM9272Hexahydrate
Microscope, ConfocalLeicaSP8
Microscope, LightVWR76382-982DMiL Inverted
MTS - Promega One StepPromegaG3581
Multi-channel pipette, 0.5-10 µLEppendorfZ683914
Multi-channel pipette, 10-100 µLEppendorfZ683930
Multi-channel pipette, 30-300 µLEppendorfZ683957
Nest-O-PatchHeka
Neurobasal-A MediumGibco10888022Without vitamin A
Neurobasal-A MediumGibco12348-017Phenol red free
Non-Essential Amino AcidsGibco11140-050
NOR-QH-II-66experimental compounds not available from a commercial source
ParafilmFisher Scientific50-998-9444 inch width
ParaformaldehydeEMSRT-15710
PATHCHMASTERHeka
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
Perfusion SystemNanion4000120
PFAEMSRT-15710
Phosphate Bufered SalineFisher ScientificAAJ75889K2Reagent grade
Poly-D-LysineFisher ScientificA3890401
Poly-L-LysineSigma Life SciencesP4707
Port-a-PatchNanion21000072
Potassium ChlorideSigma Life SciencesP5405
Primary AntibodyInvitrogenMA5-34653Rabbit Monoclonal
PrismGraphPad
PropofolFisher ScientificNC07586761 mL ampule
QH-II-66experimental compounds not available from a commercial source
Reagent ReservoirsVWR89094-664Sterile
Slides, 75 x 25 mmFisher Scientific12-544-7Frosted one side
Sodium BicarbonateCorning25-035-Cl
Sodium ChlorideFisher ScientificS271-3
Sodium PyruvateGibco11360-070
Synth-a-Freeze MediumGibcoR00550Cryopreservation
TMREFisher Scientific50-196-4741Reagent
TMRE KitAbcamAB113852Kit
Triton X-100Sigma AldrichNC0704309
Trypan BlueGibco15-250-061Solution, 0.4%
Trypsin/EDTAGibco25200-072Solution, 0.25%
Vortex MixerVWR97043-562
Whatman Filter PaperFisher Scientific09-927-841

参考文献

  1. Prevarskaya, N., Skryma, R., Shuba, Y. Ion channels in cancer: Are cancer hallmarks oncochannelopathies. Physiological Reviews. 98 (2), 559-621 (2018).
  2. Rao, R., et al. Ligand-gated neurotransmitter....

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