帕金森病模型中线粒体形态的组织学检查

摘要

本研究提出了一种基于免疫染色和图像分析的小鼠脑组织 原位线粒体形态分析方法。它还描述了这如何允许人们检测帕金森病模型中蛋白质聚集引起的线粒体形态的变化。

摘要

线粒体在细胞的能量代谢中起着核心作用，由于它们的能量需求量大，它们的功能对神经元尤为重要。因此，线粒体功能障碍是包括帕金森病在内的各种神经系统疾病的病理标志。线粒体网络的形状和组织具有高度可塑性，这使得细胞能够对环境线索和需求做出反应，线粒体的结构也与它们的健康密切相关。在这里，我们提出了一种基于线粒体蛋白VDAC1的免疫染色和随后的图像分析 的原 位研究线粒体形态的方案。该工具对于神经退行性疾病的研究可能特别有用，因为它可以检测由α-突触核蛋白聚集体诱导的线粒体计数和形状的细微差异，-突触核蛋白是一种与帕金森病病理学密切相关的聚集蛋白。这种方法允许人们报告，在预先形成的原纤维颅内注射帕金森模型中，与健康的相邻神经元相比，携带 pS129 病变的黑质 pars 致密多巴胺能神经元显示出线粒体碎片化（如其降低的纵横比 AR 所示）。

引言

中枢神经系统对 ATP 有强烈的需求：神经元使用 ATP 来支持离子梯度、神经递质合成、突触囊泡动员、释放和回收，并实现局部蛋白质翻译和降解。大脑使用的 ATP 中有 95% 以上是由线粒体^{产生的 1}.因此，线粒体功能障碍对神经元特别有害也就不足为奇了。事实上，线粒体功能障碍在多种神经系统疾病中起着重要作用，包括神经退行性疾病，如帕金森病 （PD） 和阿尔茨海默病 （AD）^2,3。

多个基因明确地与与线粒体功能和稳态相关的 PD 编码蛋白相关，例如 Parkin ^4,5,6、PTEN 诱导的激酶 1 （PINK1）^7,8 和 DJ-1⁹。线粒体功能障碍在 PD 中起作用的进一步证据是，使用线粒体电子传递链复合物 I 抑制剂（如鱼藤酮和 MPTP）治疗在体外和体内概括了 PD ^{的几个方面 10}。然而，需要指出的是，许多病理过程可能导致 PD 的神经元丢失，以及线粒体缺陷：氧化应激、钙稳态改变、泛素-蛋白酶体和自噬-溶酶体系统的失败以及蛋白质聚集是研究最多的（在^11、12、13 和 中回顾）。

线粒体的形状是异质的：除了单个单元外，它们通常还被发现为扩展的网状和管状网络。线粒体的结构和细胞位置对其功能至关重要¹⁴;事实上，线粒体网络是极其动态的，为了满足细胞的需要和对环境线索做出反应，它们经历了频繁的裂变、融合和线粒体自噬过程^15,16。此外，线粒体的形态与其健康状况密切相关。例如，在人类视神经萎缩中，降低线粒体活性的基因突变导致异常、细长和过度融合的线粒体¹⁷。另一方面，多种人类疾病表现出异常的线粒体形态，包括线粒体碎片化或线粒体过度融合，对线粒体功能产生有害影响（¹⁸）。在 PD 的背景下，我们和其他人之前已经表明，异常的线粒体形状与响应 α-突触核蛋白聚集体的功能障碍相关¹⁹。虽然线粒体形态学在 PD 和其他疾病的背景下已在体外进行了广泛研究 20,21,22，但缺乏从体内切片评估线粒体形态的方案。这使得在PD等疾病背景下线粒体的体内研究高度依赖于转基因动物²³或无法提供细胞分辨率的中脑提取物的评估。

在这里，提出了一种基于线粒体蛋白^{VDAC1 24} 的免疫染色，然后在石蜡包埋的组织切片中进行图像分析，原位研究线粒体形态作为其功能状态和健康状况的指标的方案。我们还在体外和体内PD模型中展示了该协议的结果：过表达SNCA（突触核蛋白α）的神经母细胞瘤细胞和来自颅内注射α-突触核蛋白预形成原纤维（PFF）的小鼠的脑组织。使用针对 α-突触核蛋白（在细胞中）或磷酸化 Ser129-α-突触核蛋白 pS129（在小鼠大脑中）的抗体进行免疫共染色使我们能够识别样品中具有聚集蛋白病理学的细胞（分别过表达α-突触核蛋白和 α-突触核蛋白原纤维），而阴性细胞作为相同样本中的非病理对照。通过该分析和此处描述的数据，观察到纵横比降低，表明过表达 SNCA 或呈现 pS129 病变的细胞中线粒体的碎片化。

研究方案

本节中描述的所有程序均根据巴斯克地区大学参考 M20/2022/212、巴斯克地区政府、西班牙政府和欧盟提供的道德框架执行。

1. SNCA过表达SH-SY5Y细胞的线粒体形态分析

注意：这里提供了用于研究的 体外 材料的生成的简要说明，这将作为 原位 获得结果的比较。建议在启动线粒体形态 学的体内 实验之前进行此类分析，因为它将确保所有适当的成像和分析设置都到位。

1. 为了增加细胞附着并促进细胞粘附在平坦的光学底部 96 孔板上，通过移液在 DMEM F12 中加入 25 μL/孔 1：1000 的涂层基质（参见 材料表）。将板在37°C和5%CO₂下孵育1小时。
2. 使用 Neubauer 腔室计数 SH-SY5Y。通过移液除去包被基质，并在补充有10%FBS，2mM谷氨酰胺和青霉素/链霉素的50μL /孔DMEM F-12中将10.000个细胞/孔接种在包被的96孔板上（参见 材料表）。
3. 将细胞在37°C和5%CO₂下孵育24小时。
4. 制备 250 ng 携带人野生型 SNCA、0.250 μL 转染试剂、0.250 L 转染佐剂和每孔最多 50 μL 的转染培养基的混合物（参见 材料表）。考虑实验中的孔总数，准备一个主解决方案。
5. 通过手动移液除去培养基，并通过移液加入50μL/孔的步骤1.4中制备的溶液。在37°C，5%CO₂孵育。
6. h 转染后，通过移液除去转染培养基，并在 PBS 中加入 25 μL/孔的 4% 多聚甲醛 （PFA）。
   注意：多聚甲醛是一种有毒的固定剂;使用适当的个人防护装备。
7. 在室温（R.T）下孵育5分钟。通过移液除去固定溶液，并加入 50 μL/孔 PBS 洗涤一次。通过移液除去PBS。
8. 用0.05%吐温（TBS-T）和10%正常驴血清（NDS，见 材料表）移液25μL/孔TBS。在R.T.孵育1小时以阻断任何非特异性信号。
9. 根据要分析的孔数，在TBS-T中制备兔抗α-突触核蛋白抗体MJFR1 1：1000和小鼠抗TOMM20抗体1：100的溶液（见 材料表）。
10. 通过移液除去步骤1.8中的封闭溶液，并加入25μL/孔的步骤1.9制备的一抗混合物。在4°C孵育过夜。
11. 除去一抗溶液，通过移液加入和除去 50 μL/孔 TBS-T 洗涤 3 次。
12. 根据要分析的孔数，在TBS-T中制备绿色二抗小鼠1：1000和红色二抗抗兔1：1000的溶液（见 材料表）。
13. 从步骤1.11中描述的最后一次洗涤中抽吸PBS后，使用移液管加入25μL /孔的二抗混合物，并将板在RT下孵育1小时。
14. 通过移液除去二抗溶液，并在 TBS-T 中加入 25 μL/孔的 2 g/mL DAPI。将板在R.T.孵育5分钟
15. 使用移液管除去DAPI溶液，并用移液管加入和去除50μL /孔的TBS-T洗涤三次。
16. 用0.02%叠氮化钠移液80μL /孔PBS，并将板储存在4°C。
    注意：叠氮化钠有毒;使用适当的个人防护装备。
17. 使用配备60倍物镜的高内涵自动荧光显微镜或等效共聚焦成像系统捕获图像（参见 材料表）。
18. 按照步骤 20-3.15 使用 Fiji 对单细胞的 TOMM3.21 信号进行分析。避免任何发生细胞凋亡、坏死或有丝分裂的细胞。
    注意：为此，我们从分析中排除了在显微镜下可见的细胞凋亡，坏死或有丝分裂的形态特征，例如细胞收缩，膜起泡，细胞脱离，核凝聚，DNA片段化和浓缩核染色质组织成在单个平面上排列的粗链。

2.小鼠PFFs和PFF颅内注射的产生

注意：此处介绍了注射材料的生成和颅内注射过程。该协议改编自Luk等人²⁵。

1. 要获得 PFF，请放置含有 0.5 mL α-Syn （5 mg/mL;肽，见 材料表）在37°C和250r.p.m.的振荡器上7天，以诱导α-突触核蛋白的聚集。
2. 以 20% 振幅和 0.25 循环占空比对聚集的 α-突触核蛋白进行超声处理，直到达到最佳碎裂，并通过用透射电子显微镜对样品进行阴性染色来观察。
3. 为了制备雄性和雌性野生型C57Bl / 6小鼠（3个月大）用于纹状体PFF注射，皮下注射盐水溶液中的美洛昔康/Metacam（5mg / kg）。此外，通过每只 动物两次 0.5 mL 皮下注射给予 1 mL 无菌盐水溶液。这些治疗可防止脱水、炎症和疼痛。
4. 在诱导室中用 4% 异氟醚和 0.7 L/min O₂ 诱导麻醉。通过缺乏踏板响应来检查麻醉深度。
5. 剃掉鼠标头部的上部，然后轻轻地将动物插入加热垫上的立体定向装置的框架中。
6. 在整个注射过程中，通过面罩提供动物吸入麻醉（1%-2%异氟醚在0.7L / min_{O 2}中）来维持麻醉平面。
7. 将动物放在立体定向框架上。用三轮交替洗涤的洗必泰和 70% 乙醇对操作区域进行消毒。局部（约100μL）应用马卡因/布比卡因，皮下浸润0.25%。
8. 在皮肤上做一个 0.5 厘米的切口以暴露颅骨，并在颅骨上钻一个直径为 1 毫米的孔以暴露脑表面，在 Bregma 的以下坐标中： - 前后 0.5 毫米，内侧 +/− 2.5 毫米。
9. 用 1.5 g Hamilton 注射器以 100 nl/min 的流速将步骤 2.2 通过立体定向递送至步骤 2.8 中指示的 Bregma 和 -2.7 mm 背腹侧（来自顶部大脑）的 32 L PFF 注入步骤 32 L。注射后5分钟取出注射器。
10. 根据需要缝合伤口（尺寸：4-0,45厘米，见 材料表）缝合三到五针，并用2个双结和单结将每个伤口粘合。停止吸入麻醉剂并将鼠标从框架中取出。
11. 将鼠标留在适当的恢复笼中恢复，然后再将其放回主笼中。
12. 在接下来的一周内，每天进行术后检查。任何动物的疼痛、痛苦或不适都应每 24 小时服用一次美洛昔康/Metacam，如步骤 2.3 所示。
13. 三个月后， 通过 腹腔注射在生理盐水溶液中注射 300 μL 200 mg/mL 戊巴比妥钠。一旦疼痛反射消失，在胸部做一个切口（2-3厘米），然后抬起肋骨，露出心脏。
14. 使用连接到 23 G 蝶形针头的 50 mL 注射器，用 10 mL PBS 和 35 mL 4% 多聚甲醛在 PBS 中以 5 mL/min 的速度依次灌注。
15. 在4°C下去除脑和后缀在4%PFA中再放置24小时。 PFA处理后将其储存在4°C的70%乙醇中。
16. 将大脑放入适当的塑料包埋盒中（参见 材料表），并在RT中在95%乙醇中孵育1小时，在新鲜的95%乙醇中重复该步骤并再次孵育1小时。
17. 在R.T.下将大脑转移到100%乙醇中1小时，在新鲜的100%乙醇中重复该步骤并再次孵育1小时。
18. 将大脑转移到二甲苯或二甲苯替代品中1小时，在新鲜溶液中重复并再次孵育1小时。
19. 除去二甲苯或二甲苯替代品，并将样品在温石蜡中孵育1小时。更换石蜡并再孵育一小时。
20. 用温热的石蜡将大脑安装在包埋盒上，让它干燥过夜。使用切片机准备5μm切片（参见 材料表）并将它们安装在载玻片上。

3. 通过免疫组化对PFF注射小鼠石蜡包埋的脑切片进行线粒体形态分析

1. 通过浸入二甲苯替代品十次来为载玻片脱蜡。将载玻片在二甲苯替代品中孵育2分钟。在二甲苯替代品中再次浸泡十次。
   注意：此步骤对于去除石蜡并实现样品的再水化是必要的。
2. 补液：使用以下溶液重复步骤3.1中描述的过程：100%EtOH，95%EtOH，70%EtOH，并依次使用ddH₂O进行两次。
3. 按照以下步骤进行抗原修复和免疫染色。
   1. 首先将样品转移到ddH₂O的微波炉容器中。
   2. 预热100x柠檬酸盐缓冲液pH 6（参见 材料表），储存在4°C（洗涤剂可能已沉淀）并制备350mL新鲜的1x柠檬酸盐缓冲液。然后将柠檬酸盐缓冲液倒入带盖的方便塑料容器中。
   3. 将载玻片放入柠檬酸盐缓冲液容器中（严重：检查载玻片是否低于缓冲液的水平）并盖上盖子。
      注意： 确保盖子没有完全关闭，否则容器可能会在微波炉中爆裂。
   4. 700 W 的微波炉：4 分钟 + 5 分钟休息，1.5 分钟 + 5 分钟休息。再次补充柠檬酸盐缓冲液和微波炉 1.5 分钟 + 5 分钟休息，1.5 分钟 + 5 分钟休息，1.5 分钟 + 5 分钟休息。
   5. 将样品在冰上的柠檬酸盐缓冲液中冷却20分钟。用ddH₂O洗涤样品。
      注意：抗原修复可能因特定抗体要求而异。
4. 用纸巾擦干样品载玻片，不要接触纸巾。用巴氏笔（见 材料表）在组织碎片周围绘制矩形。
5. 将所有载玻片转移到载玻片免疫染色盒中，并用TBS + 0.05%吐温（TBS-T）轻轻洗涤几次。检查 TBS-T 液滴是否留在 pap-pen 矩形内。
6. 通过敲击纸巾从样品中取出 TBS-T。向每个矩形中加入50μL封闭溶液（TBS-T中的10%NDS）（不接触组织），并在室温下孵育1小时。
   注意：体积可能因组织的大小而异;尽量确保：（1） 不同样品的巴氏涂片区域相似，以及 （2） 所选缓冲液体积完全覆盖该区域。
7. 通过敲击纸巾从样品中去除封闭溶液。轻轻移液50μL/矩形的TBS-T中以下一抗混合物：抗酪氨酸羟化酶1：250与抗VDAC1：100和抗pSer129 α-突触核蛋白EP1536Y 1：2000（参见 材料表）。
8. 在4°C孵育过夜。
9. 通过在载玻片上移液 TBS-T 进行清洗，然后通过敲击纸巾将其取出。重复三次。
10. 通过移液 50 μL/矩形的二抗混合物加入：绿色二抗鸡、红色二抗小鼠和远红色二抗兔 1：1000 在 TBS-T 中（参见 材料表）。在37°C下在黑暗中孵育1小时。
11. 如步骤3.13所述，用TBS-T洗涤三次。
12. 在 TBS-T 中与 DAPI 2 μg/mL 孵育 1 分钟。通过敲击纸巾去除DAPI溶液。如步骤3.13所述，用TBS-T洗涤三次。
13. 使用2滴/载玻片的安装试剂将玻璃盖玻片安装在样品上（参见 材料表）。轻轻按压盖玻片以消除气泡，并让样品在R.T.下干燥1小时，然后，在4°C的避光下储存。
14. 使用配备 60 倍油物镜或共聚焦技术的结构照射荧光成像系统对不同区域的至少 50 个细胞进行成像。
15. 使用Fiji对单细胞的VDAC1信号进行分析，如以下步骤所示。
    1. 首先，通过在正或负单元格周围绘制轮廓（视情况而定）并使用“裁剪”功能来选择和隔离 感兴趣区域 （ROI ）。为了避免ROI选择中的偏差，通过考虑与分析无关的标记物（即不是线粒体标记物）的荧光信号来选择它。
16. 可选：如果图像像素化程度过高，请使用“平滑”功能获得更高的边缘清晰度。
    注意：如果将平滑功能应用于图像，请将其应用于所有后续图像。
17. 可选：使用“卷积”功能（内核模式， 在进程>过滤器中）来减少背景。
    注意： 这是可选的，由于截面较薄，因此在使用 5 m 截面时通常不需要。
18. 激活 形状描述符 ，并将“设置测量值”功能 上的阈值选项限制为阈值 （确保通过分析激活这些选项）。
19. 在“调整”菜单中，选择 阈值功能 并调整阈值级别。必须保持同一样品的所有细胞的阈值设置。
    1. 尝试确保线粒体网络的充分可视化，如本文的代表性图像所示，同时丢弃背景像素。
20. 使用分析选项卡上的 分析粒子 工具。设置适当的大小以捕获线粒体。在此示例中，size： 25-Infinity，激活： 像素单位，然后选择： 显示：蒙版 命令用于可视化结果。Fiji 将在新面板中计算并显示计数、纵横比 （AR） 和其他形状参数。
21. 根据需要对数据进行统计分析。在本实验中，使用t检验分析了使用D'Agostino和Pearson正态性检验进行正态性检验后，实验组之间Fiji计算的平均纵横比（AR）和计数的差异。

讨论

总体而言，本研究表明，免疫染色与图像分析相结合是分析线粒体形态的可靠方法。事实上，它允许量化线粒体的数量以及一些形态参数，例如细胞培养物和组织中的纵横比。线粒体的数量与样品裂变和融合机制的功能状态直接相关，而AR值则依赖于细胞器的伸长率。这种方法对于快速评估PD模型中的线粒体异常可能特别有价值，其中线粒体形态、动力学和功能的改变是众所周知的病理机制^28,29。α-突触核蛋白在帕金森病中也起着相关作用：事实上，α-突触核蛋白是路易体的成分之一，路易体是用于帕金森病患者尸检诊断的细胞质原纤维聚集体³⁰。此外，在熟悉和散发性 PD 患者中都发现了 SNCA 基因突变（³¹ 中已评价）。α-突触核蛋白在 Ser129 位点的磷酸化已被广泛证明可以标记路易体样病理学，该病理学在 PFF 损伤后出现并引起各种毒性作用^32,26。

使用这里介绍的工具，我们能够检测到在存在过表达和聚集的α-突触核蛋白（分别具有α-突触核蛋白染色的细胞和携带磷酸化Ser129α-突触核蛋白阳性病变的神经元）的情况下，线粒体数量和AR值的减少与缺乏此类病变的细胞（α-突触核蛋白和磷酸化S129α-突触核蛋白阴性细胞）相比。这些结果与先前的报告一致，表明α-突触核蛋白-线粒体的直接相互作用如何对 PD^{26,33 34} 中的线粒体功能和稳态产生毒性作用。事实上，据报道，具有 α-突触核蛋白突变的小鼠表现出增加的线粒体 DNA 损伤³⁵ 和线粒体自噬^36,37。此外，还描述了α-突触核蛋白水平升高会促进线粒体裂变/碎裂，诱导线粒体内的活性氧，并在细胞系和小鼠模型中失调线粒体蛋白表达，过表达α-突触核蛋白26,38,39。

需要强调的是，该工具高度依赖于用于研究的抗体;必须对所用抗体染料进行仔细的形态学评估，以检测适当的亚细胞区室。由于该技术基于 5 μm 切片，因此需要单焦平面来分析线粒体结构，因此没有表型并不能排除表型的存在，因为这种方法可能无法检测到线粒体形态的细微差异。

虽然这项工作和其他工作以前使用类似的方法来评估体内线粒体形态 ⁴⁰，但需要为研究界提供详细的协议以进行这种评估。本研究的意义在于，可以将该方法应用于各种体内疾病模型，以评估线粒体形态异常并识别潜在的病理学，这可能最终促进筛选用于治疗此类疾病的先导化合物。虽然这种分析目前仅限于石蜡包埋的组织，但该方法的优点是它可以应用于终末组织收集后的任何疾病模型，使其成为一种非常通用的工具。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
32 G Hamilton syringe	Hamilton	7632-01
4',6-diamidino-2-fenilindol, dihidrocloruro (DAPI)	Invitrogen	D1306
4/0 USP 45 cm suture	SSa90 pga	32345n-36u
Alexa fluor 488/594-Donkey anti-Mouse	Invitrogen	A21202; A21203	green/red dye-Donkey anti-Mouse
Alexa fluor 594/647-Donkey anti-Rabbit	Invitrogen	A21207 A31573	red/far red dye-Donkey anti-Rabbit
AlexaFluor 488-Donkey anti-Chicken	Jackson ImmunoResearch	703-545-155	green dye-Donkey anti-Chicken
Anti-PSer129 α-synuclein EP1536Y (Rabbit) antibody	Abcam	ab51253
Anti-TOM 20 (Mouse) antibody	Santa Cruz	sc-17764
Anti-Tyrosine Hydroxylase (Chicken) antibody	Abcam	ab76442
Anti-VDAC1 (Mouse) antibody	Santa Cruz	sc-390996
Anti-α-synuclein antibody MJFR1 (Rabbit)	Abcam	ab138501
Citrate buffer 100X stock: 120mM citrate buffer, 5% Tween in water (pH 6)	Home-made
Disposable base mold for tissue embedding	Fisher	22-363-553	Plastic embedding boxes
D-MEM F12	Gibco	A321331020
EVOS M7000 Imaging System	ThermoFisher Scientific		High-content automated fluorescence microscope
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270106
Flat optical bottom 96 well plates	Greiner	675090
FluorSave Reagent	Millipore	345789-20ML	Mounting reagent
Glutamine 200 mM	Gibco	25030-024
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories	H-4000	PAP-pen
Lipofectamine and Plus Reagent	Invitrogen	11668-019; 11514-015	Transfection reagent and transfection adjuvant
Matrigel	Corning	354230	Coating matrix
Microtome	ThermoFisher Scientific
Normal Donkey Serum	Gibco	PCN5000
Opti-MEM	Gibco	31985070	Transfection medium
PCDNA4 plasmid (backbone)	Addgene	41036
Penicillin/Streptomycin solution	Gibco	15140-122
SH-SY5Y cells/well	ATCC	HTB-11
Xylene substitute	Labbox	22L36504
Zeiss Axio Imager Apotome 2	Carl Zeiss		Structured illumination fluorescence imaging system
α-synuclein peptide	rpeptide	S-1010-2