用于光学和声学成像的稳定幻影材料

摘要

该协议描述了用于光学和声学生物医学成像应用的稳定，生物学相关模型材料的制造，具有独立可调的声学和光学特性。

摘要

建立提供长期稳定性的组织模拟生物光子模拟材料对于跨供应商和机构的生物医学成像设备的比较、支持国际公认标准的制定以及协助新技术的临床转化至关重要。这里介绍了一种制造工艺，该工艺产生了一种稳定、低成本、组织模拟油中共聚物的材料，用于光声、光学和超声标准化工作。

基础材料由矿物油和具有定义化学文摘服务（CAS）编号的共聚物组成。这里提出的协议产生了一种代表性材料，在5 MHz时声速c（f）= 1,481 ± 0.4 m·s-1（对应于水在20 °C时的声速），在5 MHz时声衰减α（f） = 6.1 ± 0.06 dB·cm-1，在800 nm处的光吸收μ_a（λ） = 0.05 ± 0.005 ^mm-1， 和₈₀₀ nm 处的光散射μ s'（λ） = 1 ± 0.1 ^mm-1。该材料允许通过分别改变聚合物浓度或光散射（二氧化钛）和吸收剂（油溶性染料）来独立调整声学和光学特性。展示了不同模型设计的制造，并使用光声成像确认了所得测试对象的均匀性。

由于其简单、可重复的制造工艺和耐用性，以及其生物学相关特性，该材料配方在多模态声光学标准化计划中具有很高的前景。

引言

通过技术验证^1,2建立新型光学成像生物标志物的精密度和准确性对于确保其在临床实践中的成功实施至关重要。为了实现这一目标，技术验证研究经常采用耐用的物理模型，这有助于仪器间性能评估和常规质量控制。为了在研究和临床转化中广泛使用幻影材料，需要一种简单、高度可重复的制造方案。理想的生物光子模型材料应包括以下特性³：（1）在生物学相关范围内独立可调性质;（2）机械坚固性;（3）长期稳定;（4）几何形状和结构的灵活性;（5）安全处理;（6）可从标准科学供应商处购买的广泛可用的成分;（7）成本低。目前，生物光子应用缺乏一种被广泛接受的幻影材料的标准化协议，该协议满足概述的要求，并且还包括用于混合应用的可调谐声学特性，例如光声成像（PAI）。

针对光学和声学组合应用的生物相关虚拟材料包括水凝胶^4,5，^聚乙烯醇（PVA）6,7,8,9和聚氯乙烯塑料溶胶（PVCP）10,11,12,13,14,15,16 .然而，这些材料的特点是具有某些局限性，限制了它们作为稳定的幻影材料的应用。例如，水凝胶容易脱水、机械损伤和细菌向内生长，从而限制了它们的保质期^17,18,19。添加化学品可以延长寿命，但常见的防腐剂，如甲醛²⁰或苯扎氯铵²¹，是危险的，在处理过程中需要采取谨慎措施。此外，含有水溶性染料的靶材如果不封装，可能会在基材内扩散。PVA冷冻凝胶的特点是具有更高的寿命和结构坚固性，但其制备过程涉及较长的冻融循环²²。这会限制声学和光学参数²³的独立可调性，并且如果略有变化，则可能导致不均匀性⁶，从而损害再现性。此外，在1年后观察到夹杂物中染料的扩散¹³。PVCP具有复杂的制造工艺，包括高达180-220°C的高温13,14,24,25。PVCP还缺乏与科学供应商的供应链²⁶，并且可能含有基于邻苯二甲酸酯的增塑剂，这可能会对生殖和发育造成伤害²⁷，使其成为一些国家的受控物质。

油中共聚物组合物，例如凝胶蜡28,29,30,31或基于热塑性苯乙烯弹性体^{32,33,34,35,36}的共混物，表现出良好的纵向稳定性并具有类似组织的声学和光学特性^31,35,36,37，因此在多模式应用中作为耐用的幻影候选者具有很高的潜力。此外，这类材料具有成本效益、不吸水、无毒和生物惰性^35,38。声速c（f）和声衰减系数α（f）可以通过聚合物浓度33,35,39的变化在生物学相关范围内调节（表1），而光吸收μ _a（λ）和减少的散_{射μ s}'（λ）系数可以通过添加油溶性染料或二氧化钛（TiO 2）³⁹来改变， 分别。

在这里，提出了一种简单、易于遵循的协议，用于创建适用于光学、超声或光声设备校准的耐用油中共聚物模型。所有成分都有明确的化学文摘服务（CAS）编号，并且可从标准科学供应商处轻松获得。强调了制造过程中的潜在困难，并提出了克服这些困难的方法。虽然该协议允许制造具有一系列声学和光学特性的材料，但所提出的协议产生的材料声速为~1,481 m·^s-1，与室温（20°C）下水的声速对齐⁴⁰。该值被选为代表各种现有组织特性的中性标准品（表1），从而可以建立一致且可靠的参考点进行比较。通过提供这个详细的协议，我们的目标是扩大这种有前途的幻影材料类型的吸收和制造可重复性，从而促进生物光子、声学和光声验证研究，并支持临床前和临床成像应用中的常规质量控制。

研究方案

表1：软组织中发现的声学和光学特性概述。 光学特性涵盖 600 至 900 nm 的光谱范围。应该注意的是，这些只是旨在提供一般指导的代表性值。精确值可能因实验条件（例如温度）和频率/波长而异。文献提供了更具体的价值观。*未找到具体参考资料。 请按此下载此表格。

给定的方案已被开发用于制造~120 mL的幻影材料。组件的质量可以缩放以制造不同体积的幻影材料。请注意，对于较大的体积（>500 mL），建议的设备可能无法充分均匀地加热虚拟混合物。为此，应适当调整加热设备。

注意：始终确保在整个制造过程中佩戴合适的个人防护装备（PPE）。这可能包括使用实验室外套、护目镜和安全手套;参考并遵守当地安全准则。该程序改编自 Hacker 等人 ³⁹; 步骤 1 显示了这些步骤的摘要。

图1：油中共聚物材料的制造 。 （1）将用于光散射和吸收的材料添加到矿物油中，（2）在90°C超声处理直至溶解。（3）加入聚合物和稳定剂，（4）在低搅拌下在油浴中将混合物加热至160°C。（5）所有组分溶解后，将样品倒入合适的幻像模具中，（6）在室温下硬化。该图转载自Hacker等人³⁹。 请点击此处查看此图的大图。

1. 混合物的制备

1. 通过将 0.4 g Nigrosin 加入 40 mL 矿物油来制备 Nigrosin 储备溶液。通过超声处理和彻底涡旋样品确保均匀混合。将储备溶液储存在室温下。
   注意：储备溶液在重复使用前应始终彻底混合。如果首选没有光散射体（TiO 2）或吸收体（染料）的幻影材料，则可以跳过步骤1和₂。继续执行步骤 3。
2. 在100 mL（83.8 g）矿物油中超声处理0.15 gTiO 2和1 mL染料储备溶液，直到所有组分完全溶解（~60分钟）（图1：步骤1和₂）。如果设备允许，将超声仪设置为高温（90°C），因为这有利于混合过程。在超声处理时间内继续执行步骤3-5。
   注意：如果首选具有更高吸收和散射特性的模型，则可能需要延长超声处理时间。
3. 称取所需浓度（例如，SEBS = 25.14 g;LDPE = 6.70 g）（图 1：步骤 3）。
   1. 可选：可以添加抗氧化剂以增加稳定性，但如果加热温度不超过 180°C，则不是强制性的。
      注意：如果在制造过程的后期阶段遇到溶解度或粘度问题，建议排除LDPE。加入LDPE以提高材料中的声速（表3）;但是，创建稳定的幻像不是必需的。通过省略LDPE，可以简化制造和成型过程，但会导致最终材料的后续声速降低（表3）。
4. 使用合适的玻璃器皿和硅油制作油浴;小心地将其固定在电炉上。确保热电偶保留在硅油浴中，并且在整个过程中不会接触玻璃器皿的边缘（图2）。
   注：确保按照设备制造商的说明仔细安装温度调节附件。
5. 在油浴内放置足够长度的磁力搅拌棒，以确保热量均匀分布。
6. 打开加热板，将加热温度设置为160°C，并将搅拌器的每分钟转数（rpm）设置为50。
7. 将LDPE和SEBS转移到含有超声矿物油（含TiO₂ 和Nigrosin）的玻璃烧杯中。将足够长度的磁力搅拌棒引入玻璃烧杯中，并将其转移到油浴的中心以加热被测组件。确保浴液中的油位保持在烧杯内的矿物油液位以上（图1：步骤4）。

2. 加热混合物

1. 如果在任何阶段添加的聚合物似乎漂浮在矿物油上，请使用金属刮刀手动搅拌矿物油溶液，以便任何漂浮的聚合物分布在矿物油内。戴上耐热手套。
2. 将混合物保持在160°C，直到所有聚合物溶解并且溶液看起来均匀混合，具有光滑均匀的质地（~1.5小时）。

3. 吸尘

注意：要去除气泡，请按照以下步骤操作，具体取决于可用的设备。

1. 将热烧杯小心地放入真空室中，并在最高设置（最低真空）下将样品 真空 2-3分钟。使用金属刮刀小心地去除积聚在表面上的任何气泡。如果在此步骤后仍然存在气泡，请重新加热混合物并重复吸尘步骤，直到去除所有气泡。
2. 打开 真空烤箱 并将其加热至160°C。 达到所需温度后，将装有溶液的烧杯转移到真空烤箱中。
   注意：始终戴上热防护手套处理烧杯。
   1. 将真空打开到可用的最高设置（最低真空）。如果在溶液顶部产生了泡沫层，请关闭真空并使用刮刀从表面上去除气泡（重复此步骤，直到去除所有气泡）。
   2. 将烧杯在真空炉中以最高真空设置放置1小时。
      注意：为保持真空烤箱清洁，请用纸巾清洁烧杯的硅油外表面。

4. 将样品倒入模具中

1. 在将样品倒入样品模具之前，如有必要，用刮刀去除混合物表面残留的气泡。
2. 小心地将溶液倒入合适的模具中，戴上耐热手套或使用足够的防护设备。确保从低高度平稳地倾倒，以减少形成任何气泡的机会（图1：步骤5）。对于形状复杂的模具，在浇注之前在模具上涂上一层薄薄的油（矿物油[例如蓖麻油或硅油]除外），以便于去除固化的样品。
   注意：在烘箱中预热模具有助于实现更高的样品均匀性。
3. 倒入后，用金属刮刀快速去除样品顶部的任何气泡。如果混合物中积聚了许多气泡，请重复真空步骤，前提是模具的类型和形状允许。
4. 让溶液在室温下凝固。虽然较小的样品可以在不到2小时内固化，但将样品放置过夜以消除任何不完全固化的风险。将样品储存在室温下（图1：步骤6）。

5. 图像采集

1. 对于图像采集，请将模型放置在成像设备的视野中。
2. 对于PAI或超声系统，例如，使用超声凝胶或水对幻影表面与超声换能器进行声耦合。
   注意：如果协议得到正确遵循，则不会有不均匀性干扰视野。定制的虚拟支架可以帮助在测量之间进行可重复的样品定位。
3. 如果采集温度与虚拟的存储温度不同，请让虚拟温度与周围环境保持稳定。
4. 获取图像。

6. 材料表征测量

注意： 材料表征测量的目的是验证材料的光学和声学特性。应该注意的是，幻影制造方案已显示出高重现性³⁹，因此，如果需要进一步的验证研究，则仅提供以下通用测量协议作为指导。测量的各个步骤将取决于所使用的表征设备。在这里，使用基于宽带通过传输替代方法⁴¹（英国国家物理实验室（NPL）提供）的系统进行声学表征，并使用内部双积分球（DIS）系统（基于⁴²）进行光学表征。表征系统的设置显示在补充图1中。有关测量设置（声学43;光学^42,44）和测量程序³⁹的更多详细信息^，请参见其他专题。测量程序应根据所使用的每个特定表征系统进行调整。

1. 声学表征
   注意：声学表征测量基于采用10 MHz中心频率超声换能器（有源晶片直径为10 mm）进行脉冲生成和宽带水听器（30 mm有源晶片直径bilaminar膜水听器）进行脉冲检测的系统（两者都放置在装满去离子水的水箱中;尺寸为112 cm x 38 cm x 30 cm³).传感器由脉冲发生器接收器驱动。波形是使用示波器采集的。有关设置和测量程序（包括系统特定的B型对测量的影响）的更多详细信息，请参见 ⁴³。
   1. 准备适合测量设置的样品（例如，在这种情况下，直径为7-8厘米，厚度为6-9毫米的圆形样品）。确保样品成分均匀，没有任何杂质、气泡或表面不规则。
   2. 使用游标卡尺测量测试样品的厚度，并使用校准的温度计记录水箱的温度。
   3. 将样品放入系统中。确保样品与系统组件正确对齐。
      注意：基于万向节支架⁴³ 的自动控制样品架可以帮助精确控制样品的旋转和倾斜。
   4. 为每个测量集采集四个声脉冲：声路中没有样本的参考通水脉冲;通过样品传输;以及发射器从样品的正面和背面接收的声反射。
   5. 从测量中得出样品的声学特性。使用等式 （1）⁴³ 计算声速 c（f）（单位为 m·s⁻¹）。
      （1）
      C_W表示水声的温度相关速度，θ₁（f）、θ₂（f）、θ_w（f） 和 θ_s（f） 分别是前反射、背反射、通过水和通过采样电压脉冲的相应未包裹相位谱。材料的频率相关衰减系数（α i（f））可以使用公式（2）⁴³所示的双样品置换技术得出。
      （二）
      U_w（f）和U_s（f）分别是通水和通样脉冲的电压幅度谱，α_w（f）是纯水在特定水箱温度⁴⁵下的超声衰减系数（单位为dB·^cm-1），d 1和d 2（d₂>d₁）是两个样品厚度。
      注：对于本协议，评估了界面损耗的衰减，发现其影响可以忽略不计。
   6. 在测试样品的不同位置重复测量三次以上。计算测量值的平均值和标准偏差，以得出最终样本值。
2. 光学表征
   注意：对于光学测试，使用了双积分球系统（基于 ⁴²），采用两个积分球（50毫米内径），通过两根光纤 连接到 两个光谱仪。反射球通过第三根光纤 连接到 光源。
   1. 准备适合测量设置的样品（例如，在这种情况下，宽度为 5.9 cm、高度为 1.8 cm、厚度范围在 2 到 3 mm 之间的矩形样品）。确保样品成分均匀，没有任何杂质、气泡或表面不规则。
   2. 打开光源，使其根据制造商的说明稳定下来（例如，15分钟）。
   3. 使用游标卡尺确定样品的厚度。如果适用，请指定测量的波长范围和步长（例如，450-900 nm，步长为1 nm）。
   4. 记录透射球和反射球的参考测量值。
      1. 对于反射球，首先通过记录反射率值R0进行开口测量，去除透射球并打开光源。然后，用参考标准品记录反射率值 R1，将参考标准放在反射球（光源打开）前面。
      2. 对于透射球，首先通过在关闭对齐的反射率和透射率球体和光源的情况下记录透射率值 T0来进行遮挡光束测量。然后，通过在对齐的反射率和透射率球体和光源打开的情况下记录透射率值 T1来进行入射光束测量。
         注意：测量必须确保球体和参考标准品的清洁表面，因为灰尘或其他污染物的附着可能会影响组件的性能⁴⁶.
   5. 将样品放在球体之间。测量反射率 Rs 和透射率 Ts 值。确保样品未被压缩，因为这可能会影响测量精度。将一个球体放在电动载物台上可能有助于通过使其适应测量的样品厚度来精确控制球体之间的距离。
   6. 使用公式 （3） 和 （4）⁴² 计算归一化反射率 M _R 和透射率 M_T 值。
      （三）
      （四）
      R_STD 描述了从99%反射率标准反射的强度。
   7. 将测量值输入逆加倍（IAD）程序（源代码：http://omlc.org/software/iad/）⁴⁴ ，以估计材料的光学特性。
      注意：根据以前的报告，散射各向异性因子（g）可以取为g = 0.7，折射率为n = 1.4 ³⁰。
   8. 在沿测试样品的不同位置重复测量至少三次。计算测量值的平均值和标准偏差，以得出最终样本值。

讨论

在这里，提出了一个协议，旨在为稳定的生物相关材料提供通用配方，可用于创建用于多模态声学和光学生物医学成像应用的校准测量和标准化的模型。该材料先前已被证明在时间内稳定³⁹，具有高批次间重现性，使用安全，并且由标准科学供应商提供的现成、具有成本效益的成分组成。材料属性在相关的声学和光学范围内独立可调。此外，它具有机械坚固性且不溶于水，因此可以承受粗暴处理，并且对用于超声波/光声研究的水基偶联剂呈惰性。有人强调，可以使用不同类型的夹杂物创建不同的模型设计，这些夹杂物由相同或不同的材料类型组成。鉴于这些特性，该材料满足上述理想生物光子模型的关键标准，并且与其他现有的组织模拟材料相比显示出关键优势³。通过详细说明确切的制造过程，我们希望最大限度地减少制造过程中出现的变化，从而优化其用于校准、验证和跟踪成像系统性能的使用。

已经确定了两个关键步骤对制造过程至关重要。首先，需要将成分充分混合并均匀加热，以形成均匀的材料。使用超声仪和磁力搅拌器进行混合，使用油浴进行加热，确保材料成分在基质内均匀分布。需要注意的是，油浴不要达到非常高的温度（>180°C），因为这会导致材料成分氧化，导致变黄。手动搅拌可以支持混合过程，并补偿材料-空气界面的热量不足。当使用较高浓度的TiO₂ 和/或聚合物以确保材料的均匀组成时，可能需要延长超声处理和混合的时间。其次，需要去除气泡以防止在基质内形成异质性。虽然这可以通过真空泵或烤箱来实现，但也应从低处小心倾倒，以尽量减少材料内的空气滞留。

该材料的一个显着优点是其热塑性特性（源自SEBS聚合物），允许其重新加热和重塑，而不会对其声学和光学性能产生任何显着影响³⁹。然而，再加热需要逐渐小心地进行，因为如果再加热太快，材料很容易燃烧和氧化。当使用较高的LDPE浓度时，再加热也变得更加困难，因为LDPE不表现出与SEBS相同的热塑性行为。

该协议仍然存在一些限制。由于聚合物的高熔融温度（150°C），幻影模具需要由耐热材料制成，例如玻璃或不锈钢。此外，如果使用高聚合物浓度来调节声学特性，则材料在液态下相当粘稠，使得填充小成像目标变得困难。最后，声学特性的调谐到目前为止仅限于~1450-1,516 m·^s-1的声速范围，该声速范围支持模拟组织，如乳房或脂肪（c = 1,450-1,480 m·s−1），但对于肌肉或肾脏等组织（c > 1,520 m·s⁻¹）可能不足。还应考虑伴随的声学衰减变化。

在这里，我们重点介绍了该材料作为超声和光学成像应用的稳定模型的应用。然而，油中共聚物材料也显示出在弹性成像应用中的价值³⁵，并且可能允许与磁共振成像等进一步的成像方式兼容。使用3D打印模具可以实现模型的解剖真实度，如类似研究29,47,48,49所示。早期的研究还证明了材料本身的3D可打印性，进一步扩展了其在加工和制造方面的灵活性。这些发展突显了该材料作为多模态成像应用中广泛使用的稳定幻影介质的令人兴奋的未来潜力。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low-density Polyethylene (LDPE)	Alfa Aesar	43949.30 CAS: 9002-88-4	6.70 g 5.8% w/w
Mineral oil	Sigma Aldrich	330779-1L CAS: 8042-47-5	83.80 g 72.5% w/w
Nigrosin	Sigma Aldrich	211680-100G CAS: 11099-03-9	0.4 g
Polystyrene-block-poly(ethylene-ran-butylene)-block-polystyrene (SEBS)	Sigma Aldrich	200557-250G CAS: 66070-58-4	25.14 g 21.7% w/w
Silicone oil for oil bath	Sigma Aldrich	85409-1L CAS: 63148-62-9 ~1 L (depending on size of oil bath)
Titanium(IV) oxide, anatase (TiO2)	Sigma Aldrich	232033 CAS: 1317-70-0	0.15 g
Antioxidant (optional; e.g., butylated hydroxytoluene)	Sigma Aldrich	W218405-1KG-K CAS: 128-37-0	may be added to prevent discolouration if higher fabrication temperatures are used
Oil-solule dyes for inclusions (optional)	e.g., Caligo safe wash relief inks, Cranfield Colours, Cwmbran, UK*		may be added depending on preferred absorption
Bath Sonicator	Ultrawave Ltd, UK*	U500H Ultrasonic Cleaning Bath*	ideally with temperature control; recommended operating frequencies between 30-50 kHz)
Crystallising dish for silicone oil bath (up to +200 °C)	any suitable supplier		(ext. diameter ~140 mm for 250 mL glass beaker)
Glass beaker (~250 mL); glass sample dishes/phantom mould	any suitable supplier
Hot plate with magnetic stirrer and thermoregulator (external probe thermocouple) with maximum temperature of > 200 °C	Thermo Fisher Scientific, UK*	Velp Scientifica AREC.X Digital Ceramic Hot Plate Stirrer*
Laboratory scales / scientific balances accurate to 0.01 g	any suitable supplier
Metallic spatula	any suitable supplier
Vaccuum oven or vaccum chamber	Memmert, Germany (Vacuum oven)* Cole-Parmer Instrument Company, UK (Vaccum chamber)*	VO29 (Vacuum oven) DWK Life Sciences (Kimble) Glass Vacuum Desiccator with Collar (Vaccum chamber)*
1. Acoustic characterization system*
Hydrophone	GEC Marconi	30 mm active element diameter bilaminar membrane hydrophone
Oscilloscope	Tektronix UK, Bracknell, UK	DPO 7254
Pulser–receiver	Olympus NDT, Waltham, MA, USA	Olympus 5073PR
Sample holder	Newport Spectra-Physics, Didcot, UK	Newport 605-4 Series Low-Distortion Axial Clamping Gimbal Optic Mount	may require additional adaptor for sample holding
Thermometer	G. H. Zeal, London, UK	UKAS-calibrated IP 39C spirit-in-glass thermometer
Ultrasound transducer	Force Technology, Brondby, Denmark	Transducer of active element diameter 10 mm
Vernier callipers	any suitable supplier
Water tank filled with deionized water	any suitable supplier		requires sufficent size (e.g., dimensions 112 × 38 × 30 cm3)
2.Optical characterization system*
Integrating sphere (two)	Avantes, Apeldoorn, the Netherlands	AvaSphere-50, 50 cm internal diameter
Light source	Avantes, Apeldoorn, the Netherlands	Avalight-HAL-s-mini
Motorized stage (optional)	Thorlabs,	Thorlabs MTS50
Optical fibres (three)	any suitable supplier
Reflectance standard	Labsphere, North Sutton, USA	99%, white, 1.25" diameter, USRS-99-010, AS-01158-060
Spectrometer	Avantes, Apeldoorn, the Netherlands	Starline Avaspec-2048
Software
Data acqusition software (e.g., Labview)	National Instruments, Austin, TX, USA
Data analysis software (e.g., Matlab)	Mathworks, Natick, USA
Inverse adding doubling (IAD) program			Source code: http://omlc.org/software/iad/
*Please note that similar equipment may also be used.