在自动化细胞处理器上制造嵌合抗原受体T细胞

摘要

本文详细介绍了临床使用的嵌合抗原受体T细胞的制造过程，特别是使用能够进行病毒转导和T细胞培养的自动化细胞处理器。我们提供建议并描述在早期临床试验的工艺开发和实施过程中应考虑的陷阱。

摘要

嵌合抗原受体（CAR）-T细胞代表了一种很有前途的免疫治疗方法，用于治疗各种恶性和非恶性疾病。CAR-T细胞是转基因T细胞，其表达嵌合蛋白，该嵌合蛋白可识别并与细胞表面靶标结合，从而杀死靶细胞。传统的CAR-T细胞制造方法劳动密集、成本高昂，并且可能存在污染风险。CliniMACS Prodigy是一种自动化细胞处理器，允许在封闭系统中以临床规模生产细胞治疗产品，从而最大限度地降低污染风险。处理在计算机的控制下半自动进行，从而最大限度地减少了人为参与该过程，从而节省了时间并减少了可变性和错误。

本手稿和视频描述了使用该处理器制造 CAR-T 细胞的 T 细胞转导 （TCT） 过程。TCT 过程涉及 CD4+/CD8+ T 细胞富集、活化、病毒载体转导、扩增和收获。使用活动矩阵（一种允许对这些步骤进行排序和计时的功能），可以广泛地定制 TCT 流程。我们根据现行药品生产质量管理规范 （cGMP） 提供 CAR-T 细胞生产的演练，并讨论支持研究性新药 （IND） 申请所需的放行测试和临床前实验。我们论证了使用半自动工艺进行临床CAR-T细胞生产的可行性，并讨论了其优缺点。最后，我们描述了一项正在进行的针对小儿B细胞恶性肿瘤的研究者发起的临床试验[NCT05480449]，作为如何在临床环境中应用这种制造工艺的一个例子。

引言

经改造表达嵌合抗原受体 （CAR） 的 T 细胞的过继转移在治疗难治性 B 细胞恶性肿瘤患者方面显示出显着的疗效 1,2,3,4,5。然而，CAR-T细胞的传统制造方法是劳动密集型的，耗时的，并且需要训练有素的技术人员来执行高度专业化的步骤。例如，自体CAR-T细胞产品的传统制造工艺包括密度梯度离心、洗脱或磁分离以富集T细胞，在无菌烧瓶中用病毒载体进行活化和转导，以及在收获和配制之前在生物反应器中扩增。最近出现了各种系统，旨在使这一过程部分自动化。例如，Miltenyi CliniMACS Prodigy（以下简称“处理器”）是一种自动化细胞处理设备，可以以自动化方式执行其中的许多步骤6,7,8,9。对传统和自动化CAR-T制造方法的深入讨论在最近的综述文章¹⁰中提出。

研究方案

所有研究均在医院机构审查委员会 （IRB） 的批准下按照机构指南进行，并且所有受试者均已对发布在试验背景下收集的数据提供知情同意。
注：该协议的第一部分提供了CAR-T制造过程的高级概述。其余部分提供了分步说明。该协议描述了使用 TCT 软件版本 1.4 的工作流程，该版本是撰写本文时的当前版本。其他版本的 TCT 软件的用户界面可能会有所不同。

1. 流程时间表和概述（表 1）

1. 在星期一（第 -1 天）准备手术，并进行飞行前检查。确保处理器和其他设备按预期运行，并且所有试剂和耗材都可用于整个生产运行。
2. 在第 0 天，在机器上安装管路组。在干浴中解冻先前冷冻保存的 T 细胞，并通过无菌焊接将它们连接到安装在仪器上的管路组。
   注：该方案假设通过单采术收集自体T细胞，冷冻保存并储存直至开始生产。虽然可以使用新鲜收集的 T 细胞，但这会增加后勤负担，因为它需要协调单采收集和 CAR-T 细胞制造。我们强烈建议使用干融工艺代替水浴，以最大限度地降低细菌污染的风险。
3. 用 CD4 和 CD8 试剂标记 T 细胞（参见 材料表）并通过磁性选择富集。
   注意：可以省略 T 细胞富集或在将细胞加载到处理器之前进行富集。见《议定书》第5节。
4. CD4+/CD8+细胞富集后，取样进行细胞计数。将 1-2 × 10⁸ ....

讨论

CAR-T细胞疗法已成为B细胞和其他恶性肿瘤的一种有前途的治疗方法。然而，传统的CAR-T细胞制造方法存在一些局限性，例如成本高、劳动密集型生产以及增加污染风险的开放步骤。最近，出现了几个半自动化平台，包括Miltenyi CliniMACS Prodigy（“处理器”），以解决这些限制。T细胞转导（TCT）过程集成到本手稿中描述的处理器中，包括封闭系统中的T细胞富集、活化、病毒转导、培养扩增和收获。目?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 x 75 borosilicate tubes	Charles River	TL1000
20 mL Reagent Bag	Miltenyi Biotec	170-076-631
50 mL Conical Tube	Fisher	05-539-10
150 mL Transfer Set	Fenwal	4R2001
2,000 mL Transfer Set	Fenwal	4R2041
7AAD	Fisher Scientific	BDB559925
Alcohol Prep	Tyco/Healthcare
Bag Access	Medline	2300E-0500
CD19 APC-Vio770 REAfinity	Miltenyi Biotec	130-113-643
CD19 CAR Detection Reagent Biotin	Miltenyi Biotec	130-129-550
CD19 PE	BD	555413
CD3 APC	BD	340440
CD4 VioBright FITC REAfinity	Miltenyi Biotec	130-113-229
CD45 VioBlue REAfinity	Miltenyi Biotec	130-110-637
CD8 APC-Vio770 REAfinity	Miltenyi Biotec	130-110-681
Cellometer Reference Beads 10um	Nexcelom	B10-02-020
Cellometer Reference Beads 15um	Nexcelom	B15-02-010
Cellometer Reference Beads 5um	Nexcelom	B05-02-050
Cellometer Slides	Nexcelom	CHT4-SD100-002
CliniMACS CD4 GMP MicroBeads	Miltenyi Biotec	276-01	The CD4 reagent
CliniMACS CD8 GMP MicroBeads	Miltenyi Biotec	275-01	The CD8 reagent
CliniMACS PBS/EDTA Buffer	Miltenyi Biotec	130-021-201	The buffer
DMSO	Origen	CP-10
Freezing Bag 50 mL	Miltenyi Biotec	200-074-400
Freezing Vial, 1.8 mL	Nunc	12565171N
Freezing Vial, 4.5 mL	Nunc	12565161N
Human AB serum	Valley Biomedical		Sterile filtered, heat inactivated
Human Serum Albumin 25%	Grifols	68516-5216-1
Human Serum Albumin 5%	Grifols	68516-5214-1
MACS GMP Recombinant Human IL-2	Miltenyi Biotec	170-076-148	The cytokines
MACS GMP T Cell TransAct	Miltenyi Biotec	200-076-202	The activation reagent
MycoSeq Mycoplasma Detection Kit	Life Technologies	4460623
Needles, Hypodermic 14G	Medline	SWD200573
Needles, SlideSafe 18G	BD	B-D305918
Pipet tips, 2-200 μL, individually wrapped	Eppendorf	022492209
Pipet tips, 50-1000 μL, individually wrapped	Eppendorf	022492225
Pipets 10 mL	Fisher	13-678-27F
Pipets 25 mL	Fisher	13-675-30
Pipets 5 mL	Fisher	13-678-27E
Plasmalyte-A	Baxter	2B2544X	The electrolyte solution
Prodigy TS520 Tubing Set	Miltenyi Biotec	170-076- 600	The tubing set
Sterile Field	Medline	NON21001
Streptavidin PE-Vio770	Miltenyi Biotec	130-106-793
Syringe 1 mL	BD	309628
Syringe 10 mL	BD	302995
Syringe 3 mL	BD	309657
Syringe 30 mL	BD	302832
Syringe 50 mL	BD	309653
TexMACS GMP Medium	Miltenyi Biotec	170-076-306	The medium
Triple Sampling Adapter	Miltenyi Biotec	170-076-609
Viral Vector	CHOP Clinical Vector Core		huCART19
Equipment
Biological Safety Cabinet	The Baker Co
Cellometer Auto 2000	Nexcelom
CliniMACS Prodigy	Miltenyi Biotec	200-075-301	The processor
Controlled Rate Freezer	Planer/Kryosave
Endosafe nexgen-PTS150K	Charles River
Mettler Balance	Mettler
Refrigerated Centrifuge	Thermo Fisher
Refrigerated Centrifuge	Fisher Sci
SCD Sterile Tubing Welder	Terumo
Sebra Tube Sealer	Sebra
Varitherm	Barkey		The dry thaw device
XN-330 Hematology Analyzer	Sysmex